Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press156810.17650/1726-9784-2025-24-3-36-44ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИModification of the red fluorescent protein TagRFP to reduce its immunogenicity in establishing fluorescent model tumors in immunocompetent Balb / C miceMодификация красного флуоресцентного белка TagRFP для уменьшения его иммуногенности при создании флуоресцирующих модельных опухолей иммунокомпетентных мышей Balb / Chttps://orcid.org/0000-0003-1032-0959MarynichNadezhda K.МарыничН. К.
Russian Federation

33, bld. 2 Leninsky Prospekt, Moscow 119071

119071 Москва, Ленинский пр-кт, 33, стр. 2

https://orcid.org/0000-0002-2822-5143GavshinaAlexandra V.ГавшинаА. В.
Russian Federation

33, bld. 2 Leninsky Prospekt, Moscow 119071

119071 Москва, Ленинский пр-кт, 33, стр. 2

https://orcid.org/0000-0001-9732-8149MeerovichIrina G.МееровичИ. Г.
Russian Federation

Irina Gennad’evna Meerovich 

33, bld. 2 Leninsky Prospekt, Moscow 119071

Ирина Геннадьевна Меерович 

119071 Москва, Ленинский пр-кт, 33, стр. 2

imeerovich@inbi.ras.ruA. N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of SciencesИнститут биохимии им. А. Н. Баха ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук»30092025243364430092025https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1568

Background. Long-wave fluorescent proteins (FP) exhibit significant potential for in vivo investigations involving fluorescent tumor models in laboratory animals. If tumors expressing FP exhibit enhanced immunogenicity in a specific strain of immunocompetent mice as compared with the original tumors, it becomes challenging to delineate the immune component contributing to the antitumor effects of cytotoxic therapy.

Aim. To establish mouse tumor cell lines 4T1 that consistently express the original protein TagRFP and the mutant protein TagRFP-L228A, to develop tumor models based on these cell lines, and to assess the humoral immune response of Balb / c mice to such tumors.

Materials and methods. Eukaryotic plasmids pcDNA3 containing genes encoding the expression of the original protein TagRFP (TagRFP-WT) and the L228A mutant protein (TagRFP-L228A) were obtained from prokaryotic plasmids by genetic engineering methods. Individual 4T1 tumor cell clones expressing TagRFP-WT and TagRFP-L228A were obtained by sequential liposomal transfection of cells with eukaryotic plasmids, selection, and cloning. Tumor models were obtained by subcutaneous inoculation of suspensions of 4T1, 4T1-TagRFP-WT, and 4T1-TagRFP-L228A cells into female Balb / c mice. After 4 weeks, the immune response to TagRFP protein was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by binding of mouse venous blood sera to the parent TagRFP-WT protein.

Results. Plasmids for the expression of TagRFP-WT and TagRFP-L228A proteins in eukaryotic cells and 4T1 cell clones stably expressing these proteins have been obtained. After inoculation of 4T1-TagRFP-WT, 4T1-TagRFP-L228A and 4T1 cells, tumors developed in all mice of the corresponding groups. Using an ELISA on microplates with adsorbed TagRFP-WT protein, the presence of a humoral immune response to the original fluorescent protein was shown in Balb / c mice with fluorescent tumors, in contrast to mice with 4T1 tumors. Compared to the sera of mice with the 4T1-TagRFP-WT tumors, the binding to the original protein TagRFP-WT of the sera of mice with the 4T1-TagRFP-L228A tumors decreases by more than 4 times.

Conclusion. The single amino acid substitution L228A in the TagRFP protein leads to a significant reduction in the humoral immune response to the TagRFP-L228A protein expressed by tumors compared to the original TagRFP-WT. This will allow using TagRFP-L228A expressing cell lines to create optimized tumor models for Balb / c mice.

Введение. Длинноволновые флуоресцентные белки наиболее перспективны при исследованиях in vivo на флуоресцирующих моделях опухолей лабораторных животных. Если экспрессирующие флуоресцентные белки опухоли имеют большую иммуногенность для данной линии иммунокомпетентных мышей по сравнению с исходными, то сложно вычленить иммунную составляющую противоопухолевого действия цитотоксической терапии.

Цель исследования – получение мышиных опухолевых клеточных линий 4T1, стабильно экспрессирующих исходный красный флуоресцентный белок TagRFP и мутантный белок TagRFP-L228A, получение опухолевых моделей на их основе и оценка гуморального иммунного ответа мышей линии Balb / c на такие опухоли.

Материалы и методы. Эукариотические плазмиды pcDNA3, содержащие гены, кодирующие экспрессию исходного белка TagRFP (TagRFP-WT) и белка с мутацией L228A (TagRFP-L228A), получали из прокариотических плазмид генно-инженерными методами. Индивидуальные клоны опухолевых клеток 4T1, экспрессирующие TagRFP-WT и TagRFP-L228A, получали путем последовательной липосомальной трансфекции клеток эукариотическими плазмидами, селекции и клонирования. Опухолевые модели получали подкожной инокуляцией суспензии клеток 4T1, 4T1-TagRFP-WT и 4T1-TagRFP-L228A самкам мышей Balb / c. Через 4 нед оценивали иммунный ответ на белок TagRFP методом иммуноферментного анализа по связыванию сывороток венозной крови мышей с исходным белком TagRFP-WT.

Результаты. Получены плазмиды для экспрессии белков TagRFP-WT и TagRFP-L228A в эукариотических клетках и клоны клеток 4T1, стабильно экспрессирующие эти белки. После инокуляции клеток 4T1-TagRFP-WT, 4T1-TagRFP-L228A и 4T1 опухоли развились у всех мышей соответствующих групп. Методом иммуноферментного анализа на планшетах с адсорбированным белком TagRFP-WT показано наличие у мышей Balb / c с флуоресцирующими опухолями гуморального иммунного ответа на исходный флуоресцентный белок в отличие от такового у мышей с опухолями 4T1. По сравнению с сыворотками мышей с опухолью 4T1-TagRFP-WT связывание с исходным белком TagRFP-WT сывороток мышей с опухолями 4T1-TagRFP-L228A уменьшается более чем в 4 раза.

Заключение. Единственная аминокислотная замена L228A в белке TagRFP приводит к существенному уменьшению гуморального иммунного ответа на экспрессируемый опухолями белок TagRFP-L228A по сравнению с исходным TagRFP-WT. Это позволит использовать экспрессирующие TagRFP-L228A клеточные линии для создания оптимизированных опухолевых моделей для мышей Balb / c.

red fluorescent protein TagRFPimmunogenicitytumor modelhumoral immune responseenzymelinked immunosorbent assayкрасный флуоресцентный белок TagRFPиммуногенностьопухолевая модельгуморальный иммунный ответиммуноферментный анализThe research was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 24-24-00550).Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 24-24-00550).Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V. et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J 2009;418(3):567–74. DOI: 10.1042/BJ20081949Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V. et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J 2009;418(3):567–74. DOI: 10.1042/BJ20081949Savitsky A.P., Meerovich I.G., Zherdeva V.V. et al. Threedimensional in vivo imaging of tumors expressing red fluorescent proteins. In: In Vivo Cellular Imaging Using Fluorescent Proteins; Robert M. Hoffman (ed.)., Springer Science+Business Media New York 2012, 872. DOI: 10.1007/978-1-61779-797-2_7Mishchenko T.A., Balalaeva I.V., Klimenko M.O. et al. Far-red fluorescent murine glioma model for accurate assessment of brain tumor progression. Cancers (Basel) 2022;14(15):3822. DOI: 10.3390/cancers14153822Kubota Y., Aoki Y., Wang A. et al. Non-invasive fluorescence imaging of breast cancer metastasis to the brain in an orthotopic nude-mouse model with very-narrow-band-width laser excitation of red fluorescent protein resulting in an ultra-bright signal without skin autofluorescence. In Vivo 2024;38(1):69–72. DOI: 10.21873/invivo.13411Zherdeva V.V., Kazachkina N.I., Shcheslavskiy V., Savitsky A.P. Long-term fluorescence lifetime imaging of a genetically encoded sensor for caspase-3 activity in mouse tumor xenografts. J Biomed Opt 2018;23(3):1–11. DOI: 10.1117/1.JBO.23.3.03500Galluzzi L., Guilbaud E., Schmidt D. et al. Targeting immunogenic cell stress and death for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 2024;23(6):445–60. DOI: 10/1038/s41573-024-00920-9Tan L., Shen X., He Zh., Lu Y. The role of photodynamic therapy in triggering cell death and facilitating antitumor immunology. Front Oncol 2022;12:863107. DOI: 10.3389/fonc.2022.863107Alzeibak R., Mishchenko T.A., Shilyagina N.Y. et al. Targeting immunogenic cancer cell death by photodynamic therapy: past, present and future. J Immunother Cancer 2021;9(1):e001926. DOI: 10.1136/jitc-2020-001926Chou W., Sun T., Peng N. et al. Photodynamic therapy-induced anti-tumor immunity: influence factors and synergistic enhancement strategies. Pharmaceutics 2023;15(1):2617. DOI: 10.3390/pharmaceutics15112617Hoffman R.M. Fluorescent proteins as visible in vivo sensors. Prog Mol Biol Transl Sci 2013;113:389–402. DOI: 10.1016/B978-0-12-386932-6.00010-7Hoffman R.M. Fluorescent proteins as visible in vivo sensors. Prog Mol Biol Transl Sci 2013;113:389–402. DOI: 10.1016/B978-0-12-386932-6.00010-7Steinbauer M., Guba M., Cernaianu G. et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin Exp Metastasis 2003;20(2): 135–41. DOI: 10.1023/a:1022618909921Vodopyanov S.S., Kunin M.A., Garanina A.S. et al. Preparation and testing of cells expressing fluorescent proteins for intravital imaging of tumor microenvironment. Bull Exp Biol Med 2019;167(1):123–30. DOI: 10.1007/s10517-019-04475-312Vodopyanov S.S., Kunin M.A., Garanina A.S. et al. Preparation and testing of cells expressing fluorescent proteins for intravital imaging of tumor microenvironment. Bull Exp Biol Med 2019;167(1):123–30. DOI: 10.1007/s10517-019-04475-312Huang L., Bommireddy R., Munoz L.E. et al. Expression of tdTomato and luciferase in a murine lung cancer alters the growth and immune microenvironment of the tumor. PLoS One 2021;16(8):e0254125. DOI: 10.1371/journal.pone.0254125Castano A.P., Liu Q., Hamblin M.R. A green fluorescent protein-expressing murine tumour but not its wild-type counterpart is cured by photodynamic therapy. Br J Cancer 2006;94(3):391–7. DOI: 10.1023/A:10226189099218Castano A.P., Liu Q., Hamblin M.R. A green fluorescent protein-expressing murine tumour but not its wild-type counterpart is cured by photodynamic therapy. Br J Cancer 2006;94(3):391–7. DOI: 10.1023/A:10226189099218Skelton D., Satake N., Kohn D.B. The enhanced green fluorescent protein (eGFP) is minimally immunogenic in C57BL/6 mice. Gene Ther 2001;8(23):1813–4. DOI: 10.1038/sj.gt.3301586Skelton D., Satake N., Kohn D.B. The enhanced green fluorescent protein (eGFP) is minimally immunogenic in C57BL/6 mice. Gene Ther 2001;8(23):1813–4. DOI: 10.1038/sj.gt.3301586Eyes T.J. Deimmunisation of enhanced green fluorescent protein. PhD Thesis. The University of Manchester (United Kingdom), 2014.NetMHC-4.0. URL: https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHC-4.0/.ElliPro. URL: http://tools.iedb.org/ellipro.DiscoTope-3.0 Structure Base Antibody Prediction. URL: https://services.healthtech.dtu.dk/services/DiscoTope-3.0.DiscoTope-3.0 Structure Base Antibody Prediction. URL: https://services.healthtech.dtu.dk/services/DiscoTope-3.0.Meerovich I.G., Marynich N.K., Gavshina A.V., Savitsky A.P. Mutants of the red fluorescent protein TagRFP with reduced immunogenicity for use in fluorescent tumor models. In the book: VI International Conference Postgenome’2024, XI Russian Symposium Proteins and Peptides, Russian-Chinese Congress in Life Sciences. Bulletin (Collection) of abstracts. Moscow: Pero Publishing House, 2024. (In Russ.).Меерович И.Г., Марынич Н.К., Гавшина А.В., Савицкий А.П. Мутанты красного флуоресцентного белка TagRFP с пониженной иммуногенностью для использования во флуоресцирующих опухолевых моделях. В кн.: VI Международная конференция «Постгеном’2024», XI Российский симпозиум «Белки и пептиды», Российско-китайский конгресс в области наук о жизни. Сборник тезисов докладов. М.: Перо, 2024.Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2010. P. 208–11. DOI: 10.1002/9780470649367Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2010. P. 208–11. DOI: 10.1002/9780470649367