Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press155410.17650/1726-9784-2025-24-2-73-82ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИDevelopment and validation of bioanalytical technique for the LCS-1269 assay by high-performance liquid chromatographyРазработка и валидация биоаналитической методики определения ЛХС-1269 методом высокоэффективной жидкостной хроматографииhttps://orcid.org/0000-0003-1125-1932KozinD. A.КозинД. А.
Russian Federation

Dmitry A. Kozin.

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

Козин Дмитрий Андреевич.

115522 Москва, Каширское шоссе, 24

kozin1993@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4214-3475KulbachevskayaN. Yu.КульбачевскаяН. Ю.
Russian Federation

Natalya Yu. Kulbachevskaya.

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

115522 Москва, Каширское шоссе, 24

https://orcid.org/0000-0002-6689-4452BalykovV. A.БалыковВ. А.
Russian Federation

Vitaly A. Balykov.

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

115522 Москва, Каширское шоссе, 24

https://orcid.org/0000-0003-3034-750XShprakhZ. S.ШпрахЗ. С.
Russian Federation

Zoya S. Shprakh.

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522

115522 Москва, Каширское шоссе, 24

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of RussiaФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России1507202524273821507202515072025https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1554

Background. The glycosylated derivative of indolo[2,3-a]carbazole LCS-1269, an DNA intercalator and a chromatin remodulator, synthesized in N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology (N.N. Blokhin NMRCO), is of great interest for the treatment of malignant tumors. To carry out pharmacokinetic studies of LCS-1269 dosage forms in vivo, it is necessary to develop a method for LCS-1269 assay in biological samples.

Aim. To develop and validate an analytical technique using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV) for LCS-1269 pharmacokinetic studies.

Materials and methods. The study used the LCS-1269 substance containing 99.4 % of the active component, blood plasma and liver of healthy cyclic immunocompetent laboratory mice hybrid (C57Bl/6J×DBA2) F1 of N.N. Blokhin NMRCO breeding. Acetonitrile and sodium chloride were used to prepare biological samples. Reversed-phase HPLC-UV method in the gradient regimen was used for LCS-1269 assay. Statistical processing of the obtained results was carried out in Microsoft Office Excel 2010 software.

Results. The technique based on cooled acetonitrile deproteinization was developed for blood plasma sample preparation; liver samples were prepared using combined cooled acetonitrile and sodium chloride deproteinization. The developed technique validation confirmed its specificity, linearity (r >0.99), correctness (response >80 % at low concentrations) and precision (relative standard deviation <3.5 %) in the entire analytical range; LCS-1269 transfer effect wasn’t observed. It was found that the analyzed samples are stable for 24 hours at room temperature, and the model mixtures are stable during a month when stored at temperatures less than –18 °C.

Conclusion. A bioanalytical technique for LCS-1269 assay in the blood plasma and liver of animals using HPLC-UV has been developed. Has been shown that the technique meets the requirements of the Eurasian Economic Union for the validation of biological samples analysis.

Введение. Синтезированное в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина гликозилированное производное индоло-[2,3-а]карбазола ЛХС-1269 – интеркалятора дезоксирибонуклеиновой кислоты и ремодулятора хроматина – представляет большой интерес для терапии злокачественных новообразований. Для проведения фармакокинетических исследований лекарственных форм ЛХС-1269 in vivo необходимо разработать методику определения ЛХС-1269 в биологических образцах.

Цель исследования – разработка и валидация биоаналитической методики с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ) для фармакокинетических исследований ЛХС-1269.

Материалы и методы. В исследовании использовали субстанцию ЛХС-1269 с содержанием действующего вещества 99,4 %, плазму крови и печень здоровых иммунокомпетентных лабораторных самок мышей-гибридов (C57Bl/6J×DBA2)F1 разведения НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Для подготовки биологических образцов применяли ацетонитрил и хлорид натрия. Определение проводили методом ВЭЖХ-УФ в обращенно-фазовом варианте в градиентном режиме. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в программе Microsoft Office Exсel 2010.

Результаты. Для подготовки образцов плазмы крови разработана методика на основе депротеинизации охлажденным ацетонитрилом; подготовку образцов печени проводили с использованием комбинированной депротеинизации охлажденным ацетонитрилом и хлоридом натрия. Валидация разработанной методики подтвердила ее специфичность, линейность (r >0,99), правильность (отклик >80 % на малых концентрациях) и прецизионность (относительное стандартное отклонение ≤3,5 %) во всем аналитическом диапазоне; показано отсутствие эффекта переноса ЛХС-1269. Установлено, что образцы для анализа стабильны в течение 24 ч при комнатной температуре, а модельные смеси – в течение 1 мес при температуре не выше –18 оС.

Заключение. Разработана биоаналитическая методика для количественного определения ЛХС-1269 в плазме крови и печени животных с применением метода ВЭЖХ-УФ, соответствующая требованиям к валидации методик для анализа биологических образцов Евразийского экономического союза.

high performance liquid chromatographypharmacokineticssample preparationdeproteinizationvalidationвысокоэффективная жидкостная хроматографияфармакокинетикапробоподготовкадепротеинизациявалидацияThe study has been conducted as part of the applied research funded under State Assignment “Preclinical and pharmaceutical development of the original domestic antitumor drug – topoisomerase I inhibitor – for the clinical trials”. The authors express their gratitude to the staff of the chemical synthesis laboratory of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors of the “N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology”, Ministry of Health of the Russia, and personally to the head of the chemical synthesis laboratory, PhD D.V. Gusev, for providing LHS-1269 substance for research.Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «Доклиническая и фармацевтическая разработка оригинального отечественного противоопухолевого лекарственного средства – ингибитора топоизомеразы I – с целью проведения клинических исследований». Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории химического синтеза Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» и лично заведующему лабораторией химического синтеза, канд. хим. наук Д.В. Гусеву за предоставленную для исследований субстанцию ЛХС-1269.Kozin D.A., Shprakh Z.S., Reshetnyak V.Yu. et al. Indolo[2,3-a]carbazole derivatives with antitumor activity and instrumental methods for their investigation (review). Razrabotka i registratsia lekarstvennyh sredstv = Drug Development & Registration 2020;9(4):128–35. (In Russ.). DOI: 10.33380/2305-2066-2020-9-4-128-135Козин Д.А., Шпрах З.С., Решетняк В.Ю. и др. Производные индоло[2,3-а]карбазола, обладающие противоопухолевой активностью, и инструментальные методы их исследования (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств 2020;9(4):128–35. DOI:10.33380/2305-2066-2020-9-4-128-135Zenkov R.G., Ektova L.V., Vlasova O.A. et al. Indolo[2,3-a]carbazoles: diversity, biological properties, application in antitumor therapy. Chemistry of Heterocyclic Compounds 2020;56(6):644–58. DOI: 10.1007/5637Ektova L.V., Eremina V.A., Tikhonova N.I. et al. Synthesis and cytotoxic activity of indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-5,7-dione n-glycosides substituted on the maleimide nitrogen atom. Pharmaceutical Chemistry Journal 2020;54(5):455–8. DOI: 10.1007/s11094-020-02222-xVartanyan A.A., Misyurin V.A., Baryshnikova M.A., Shprakh Z.S. Inhibitor of vasculogenic mimicry restores sensitivity of resistant melanoma cells to DNA-damaging agents. Melanoma Res 2017;27(1):8–16. DOI: 10.1097/CMR.0000000000000308Kalitin N.N., Ektova L.V., Kostritsa N.S. et al. A novel glycosylated indolocarbazole derivative LCS 1269 effectively inhibits growth of human cancer cells in vitro and in vivo through driving of both apoptosis and senescence by inducing of DNA damage and modulating of AKT/mTOR/S6K and ERK pathways. Chem Biol Interact 2022;364:110056. DOI: 10.1016/j.cbi.2022.110056Zenkov R.G., Vlasova O.A., Maksimova V.P. et al. Molecular mechanisms of anticancer activity of N-glycosides of indolocarbazoles LCS-1208 and LCS-1269. Molecules 2021;26(23):7329. DOI: 10.3390/molecules26237329Shprakh Z., Budko A., Kozin D. et al. Development and validation of HPLC method for analysis of indolocarbazole derivative LCS-1269. Pharmacia 2021;68(2):421–37. DOI: 10.3897/pharmacia.68.E63457Shprakh Z.S., Ignatyeva E.V., Kozin D.A. at al. Comparative analysis of methods for the quantitative determination of indolocarbazole derivative LCS-1269 in dosage form. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal = Pharmaceutical Chemistry Journal 2024;58(12):45–9. (In Russ.). DOI: 10.30906/0023-1134-2024-58-12-45-49]Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Козин Д.А. и др. Сравнительный анализ методов количественного определения производного индолокарбазола ЛХС-1269 в лекарственной форме. Химико-фармацевтический журнал 2024;58(12):45–9. DOI: 10.30906/0023-1134-2024-58-12-45-49Ingle R.G., Zeng S., Jiang H., Fang W.J. Current developments of bioanalytical sample preparation techniques in pharmaceuticals. J Pharm Anal 2022;12(4):517–29. DOI: 10.1016/j.jpha.2022.03.001