Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press124510.17650/1726-9784-2021-20-1-56-66ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИEFFECT OF INTERLEUKINS 2, 7, 15 ON THE PROLIFERATION OF NATURAL KILLERS IN VITROВЛИЯНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ 2, 7, 15 НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ IN VITROhttps://orcid.org/0000-0002-6035-1756SitkovskayaA. О.СитковскаяА. О.
Russian Federation

Anastasia Olegovna Sitkovskaya 

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

Анастасия Олеговна Ситковская 

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

grankina.anastasia@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1410-122XZlatnikE. Yu.ЗлатникЕ. Ю.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

https://orcid.org/0000-0002-4558-5896FilippovaS. Yu.ФилипповаС. Ю.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

BondarenkoE. S.БондаренкоЕ. С.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

https://orcid.org/0000-0002-7302-7031VaschenkoL. N.ВащенкоЛ. Н.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

KechedzhievaЕ. Е.КечеджиеваЭ. Э.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

DashkovaI. R.ДашковаИ. Р.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

AndreikoE. A.АндрейкоЕ. А.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

https://orcid.org/0000-0002-6496-9641NovikovaI. A.НовиковаИ. А.
Russian Federation

63, 14 Liniya St., Rostov-on-Don 344000

344037 Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63

National Medical Research Centre for OncologyФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России0804202120156660704202107042021https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1245

Introduction. The actual task of modern adoptive cancer immunotherapy is the selection of the optimal composition of cytokines for ex vivo stimulation of immunocompetent cells for subsequent administration to oncological patients.

The purpose of the study was to compare the effect of interleukin (IL) 2, 7, 15 and their combinations on the proliferation of natural killer cells in breast cancer (BC) patients in vitro.

Materials and methods. The research was conducted on natural killer cells isolated by magnetic separation from mononuclear cells of peripheral blood of ten patients with locally advanced BC (stage II). After separation, the cells were cultured at a concentration of 2.5 × 105 cells / ml for 10 days in RPMI 1640 medium supplemented with cytokines at a concentration of 40 ng / ml each in five experimental variants: IL‑2; IL‑7; IL‑15; IL‑7 / IL‑15; IL‑2 / IL‑7 / IL‑15. On the 10th day of cultivation, the phenotype of cells and the cell cycle were studied by flow cytometry. For immunophenotyping of cells, we used monoclonal antibodies to antigens: CD3, CD16 / 56, CD45, CD4, CD19, and CD8. For cell cycle study cells were stained with propidium iodide.

Results. On the final 10th day of cultivation the number of living cells expressed as percentage of the seeding numbers were significantly different from control (45.9 %) in samples IL‑2 (86.8 %) and IL‑7 / IL‑15 (85.6 %), IL‑15 (76.4 %), IL‑2 / IL‑7 / IL‑15 (75.8 %). The proportion of natural killers (CD16+CD56+) significantly differed from the control (18.2 %) in samples IL‑2 (45.6 %), IL‑15 (39.9 %), IL‑7 / IL‑15 (36.2 %), IL‑2 / IL‑7 / IL‑15 (35.9 %). The propor‑ tion of natural killer T cells (CD3+ / CD16+CD56+) significantly differed from the control (0.4 %) in samples incu‑ bated with IL‑2 (2.06 %), IL‑15 (2.2 %), IL‑7 (0.9 %), IL‑7 / IL‑15 (1.26 %), IL‑2 / IL‑7 / IL‑15 (2.46 %). All experimental tests also showed a significant increase in the proportion of cells in the S‑phase and increase in the proliferation index (G2 / M + S).

Conclusion. The maximum stimulation of the proliferation of natural killer cells isolated from the blood of patients with BC in vitro was obtained by stimulation with IL‑15 alone and in combinations with γc‑cytokines.

Введение. Актуальной задачей современной адоптивной иммунотерапии рака является подбор оптимального состава цитокинов для ex vivo стимуляции иммунокомпетентных клеток для последующего введения онкологическим больным.

Цель исследования. Изучение влияния интерлейкина (ИЛ) 2, 7, 15 и их комбинаций на пролиферацию натуральных киллеров больных раком молочной железы (РМЖ) in vitro.

Материалы и методы. Материалом исследования послужили натуральные киллеры, выделенные методом магнитной сепарации из мононуклеарных клеток периферической крови 10 больных местно‑распространенным РМЖ (II стадия). После сепарации клетки культивировали в концентрации 2,5 × 105 клеток / мл в течение 10 сут в среде RPMI 1640 с добавлением цитокинов в концентрации 40 нг / мл каждого в 5 вари‑ антах опыта: ИЛ‑2, ИЛ‑7, ИЛ‑15, ИЛ‑7 / ИЛ‑15, ИЛ‑2 / ИЛ‑7 / ИЛ‑15. На 10‑е сутки культивирования проводили исследования фенотипа клеток и клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии. Для иммунофенотипирования клеток использовали моноклональные антитела к антигенам: CD3, CD16 / 56, CD45, CD4, CD19 и CD8. Для оценки ДНК использовали окрашивание клеток пропидиум йодидом.

Результаты. По окончании культивирования количество живых клеток в процентах от первоначального было достоверно выше, чем в контроле (45,9 %), в образцах ИЛ‑2 (86,8 %) и ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (85,6 %), ИЛ‑15 (76,4 %), ИЛ‑2 / ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (75,8 %). Доля натуральных киллеров (CD16+CD56+) достоверно отличалась от контроля (18,2 %) в образцах ИЛ‑2 (45,6 %), ИЛ‑15 (39,9 %), ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (36,2 %), ИЛ‑2 / ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (35,9 %). Доля натуральных киллеров Т‑клеток (CD3+CD16+CD56+) достоверно отличалась от контроля (0,4 %) в образцах ИЛ‑2 (2,06 %), ИЛ‑15 (2,2 %), ИЛ‑7 (0,9 %), ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (1,26 %), ИЛ‑2 / ИЛ‑7 / ИЛ‑15 (2,46 %). Во всех опытных пробах также наблюдалось достоверное увеличение доли клеток в S‑фазе и индекса пролиферации (G2 / M + S).

Заключение. Максимальная стимуляция пролиферации натуральных киллеров, сепарированных из крови больных РМЖ, была получена при стимуляции in vitro ИЛ‑15 и комбинациями γс‑цитокинов, включающих его. 

natural killer cellsinterleukinsbreast cancerimmunomagnetic separationcell cycleнатуральные киллерыинтерлейкинырак молочной железыиммуномагнитная сепа‑ рацияклеточный циклMushkarina T.Ju., Kuz’mina E.G. Multivariate analysis of immunity highlighting the role of regulatory T cells in radiation damage to the lungs. Medicinskij akademicheskij zhurnal = Medical academic journal 2016;16(4):161–2. (In Russ.).Мушкарина Т.Ю., Кузьмина Е.Г. Многомерный анализ иммунитета с выделением роли Т-регуляторных клеток при лучевых повреждениях легких. Медицинский академический журнал 2016;16(4):161–2.Berezhnaya N.M., Chekhun V.F. Immunology of malignant growth. Kiev: Naukova dumka, 2005. 792 p. (In Russ.).Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста. Киев: Наукова думка, 2005. 792 с.Kiselevskij M.V., Chikileva I.O., Zharkova O.V. et al. Prospects of combining interleukin-2 with immune checkpoint inhibitors for cancer therapy. Voprosy onkologii = Oncology issues 2020;66(1):23–8 (In Russ.).Киселевский М.В., Чикилева И.О., Жаркова О.В. и др. Перспективы комбинированной терапии онкологических больных интерлейкином-2 и ингибиторами контрольных иммунных точек. Вопросы онкологии 2020;66(1):23–8.Zlatnik E.Ju., Sitkovskaja A.O., Nepomnjashhaja E.M. et al. Achievements and prospects of cellular technologies based on the activated lymphocytes in the treatment of malignant tumors. Kazanskij medicinskij zhurnal = Kazan medical journal 2018;99(5):792–801 (In Russ.). DOI: 10.17816/KMJ2018-792.Златник Е.Ю., Ситковская А.О., Непомнящая Е.М. и др. Достижения и перспективы клеточных технологий на основе активированных лимфоцитов в лечении злокачественных опухолей. Казанский медицинский журнал 2018;99(5):792–801.Shamova T.V., Sitkovskaja A.O., Vashhenko L.N., Kechedzhieva Je.Je. Adoptive cell therapy: current advances. JuzhnoRossijskij onkologicheskij zhurnal = South-Russian journal of cancer 2020;1(1):43–59 (In Russ.).Шамова Т.В., Ситковская А.О., Ващенко Л.Н., Кечеджиева Э.Э. Адоптивная клеточная терапия: достижения последних лет. Южно-Российский онкологический журнал 2020;1(1):43–59.Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med 1985;313(23):1485–92. DOI: 10.1056/NEJM198512053132327.Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2-2 or high-dose interleukin-2-2 alone. N Engl J Med 1987;316(15):889–97. DOI: 10.1056/NEJM198704093161501.Kimura H., Yamaguchi Y. A phase III randomized study of interleukin-2 lymphokine-activated killer cell immunotherapy combined with chemotherapy or radiotherapy after curative or noncurative resection of primary lung carcinoma. Cancer 1997;80(1):42–9.Sitkovskaja A.O., Zlatnik E.Ju., Shamova T.V. et al. The effect of T-regulatory cells separation from blood mononuclear cells on the generation of lymphokineactivated killers. Citologija = Cytology 2020;62(10):7–13 (In Russ.).Ситковская А.О., Златник Е.Ю., Шамова Т.В. и др. Генерация лимфокин-активированных киллеров на фоне сниженного содержания Т-регуляторных клеток in vitro. Цитология 2020;62(10):7–13André F., Zielinski C.C. Optimal strategies for the treatment of metastatic triple-negative breast cancer with currently approved agents. Ann Oncol 2012;23:vi46–51. DOI: 10.1093/annonc/mds195. 11. Juliá E.P., Amante A., Pampena M.B. et al. Avelumab, an IgG1 anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor, Triggers NK Cell-Mediated Cytotoxicity and Cytokine Production Against Triple Negative Breast Cancer Cells. Front Immunol 2018;9:2140. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02140.DeGottardi M.Q., Okoye A.A., Vaidya M. et al. Effect of Anti–IL-15 Administration on T Cell and NK Cell Homeostasis in Rhesus Macaques. J Immunol 2016;197(4):1183–98. DOI: 10.4049/jimmunol.1600065.Wagner J., Pfannenstiel V., Waldmann A. et al. A Two-Phase Expansion Protocol Combining Interleukin (IL)-15 and IL-21 Improves Natural Killer Cell Proliferation and Cytotoxicity against Rhabdomyosarcoma. Front Immunol 2017;8:676. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00676.Godfrey D.I., Stankovic S., Baxter A.G. Raising the NKT cell family. Nature Immunol 2010;11(3):197–206. DOI: 10.1038/ni.1841.Borunova A.A., Chkadua G.Z., Zabotina T.N. et al. Increase in NKT cells – a marker of early progressing at adjuvant vaccinotherapy of patients with a metastatic melanoma of skin. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2019;18(4):82–9 (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784- 2019-18-4-82-89.Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н. и др. Увеличение количества NKT-клеток – маркер раннего прогрессирования при адъювантной вакцинотерапии пациентов с метастатической меланомой кожи. Российский биотерапевтический журнал 2019;18(4):82–9.Godfrey D.I., Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via CD1ddependent NKT cells. J Clin Invest 2004;114(10):1379–88. DOI: 10.1038/nri11309.Viale R., Ware R., Maricic I. et al. NKT cell subsets can exert opposing effects in autoimmunity, tumor surveillance and inflammation. Curr Immunol Rev 2012;8(4):287–96. DOI: 10.2174/157339512804806224.East J.E., Kennedy A.J., Webb T.J. Raising the roof: The preferential pharmacological stimulation of Th1 and Th2 response mediated by NKT cells. Med Res Rev 2014;34:45–76. DOI: 10.1002/med.21276.Chertkova A.I., Slavina E.G., Shoua Je.K. et al. The main parameters of cellular immunity in patients with triple-negative breast cancer: relationship with efficiency of chemotherapy. Medicinskaja immunologija = Medical immunology 2018;20(5):667–80 (In Russ.). DOI: 10.15789/1563-0625-2018-5.Черткова А.И., Славина Е.Г., Шоуа Э.К. и др. Основные параметры клеточного иммунитета у больных раком молочной железы с тройным негативным фенотипом. Медицинская иммунология 2018;20(5):667–80.Nair S., Dhodapkar M.V. Natural killer T cells in cancer immunotherapy. Front Immunol 2017;8:1178. DOI: 10.3389/fimmu.2017.01178.Bedolla D.E., Kenig S., Mitri E. et al. Further insights into the assessment of cell cycle phases by FTIR microspectroscopy. Vibrational Spectroscopy 2014;75:127–35. 22. Elledge S.J. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science 1996;274:1664–72. DOI: 10.1126/science.274.5293.1664.Bedolla D.E., Kenig S., Mitri E. et al. Further insights into the assessment of cell cycle phases by FTIR microspectroscopy. Vibrational Spectroscopy 2014;75:127–35.Akaike Y., Chibazakura T. Aberrant activation of cyclin a-CDK induces G2/m-phase checkpoint in human cells. Cell Cycle 2020;19:84–96. DOI: 10.1080/15384101.2019.1693119.Elledge S.J. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science 1996;274:1664–72. DOI: 10.1126/science.274.5293.1664.Yang M., Li L., Chen S. et al. Melatonin protects against apoptosis of megakaryocytic cells via its receptors and the AKT/mitochondrial/caspase pathway. Aging (Albany NY) 2020;12(13):13633–46. DOI: 10.18632/aging.103483.Akaike Y., Chibazakura T. Aberrant activation of cyclin a-CDK induces G2/m-phase checkpoint in human cells. Cell Cycle 2020;19:84–96. DOI: 10.1080/15384101.2019.1693119.Dejneko N.L., Dergunova N.N., Bulycheva T.I. et al. The mitogenic and toxic effects produced by phytohemagglutinin on the peripheral-blood lympnocytes of man in culture. Immunologija = Immunology 2003;4:205–8 (In Russ.).Yang M., Li L., Chen S. et al. Melatonin protects against apoptosis of megakaryocytic cells via its receptors and the AKT/mitochondrial/caspase pathway. Aging (Albany NY) 2020;12(13):13633–46. DOI: 10.18632/aging.103483.Varfolomeeva M.I., Latysheva T.V., Setdikova N.H. et al. Characteristics of peripheral blood lymphocytes in patients with general variable immunological insufficiency and a possible way of correcting the insolvency of lymphoid elements. Immunologija = Immunology 2002;6:340–3 (In Russ.).Дейнеко Н.Л., Дергунова Н.Н., Булычева Т.И. и др. Митогенное и токсическое действие фитогемагглютинина на лимфоциты периферической крови человека в культуре. Иммунология 2003;4:205–8.Romee R., Leong J.W., Fehniger T.A. Utilizing Cytokines to Function-Enable Human NK Cells for the Immunotherapy of Cancer. Scientifica (Cairo) 2014;2014:205796. DOI: 10.1155/2014/205796.Варфоломеева М.И., Латышева Т.В., Сетдикова Н.Х. и др. Характеристика лимфоцитов периферической крови у больных с общей вариабельной иммунологической недостаточностью и возможный путь коррекции несостоятельности лимфоидных элементов. Иммунология 2002;6:340–3.Zhu L., Xie X., Zhang L. et al. TBKbinding protein 1 regulates IL-15- induced autophagy and NKT cell survival. Nat Commun 2018;9(1):2812. DOI: 10.1038/s41467-018-05097-5.Romee R., Leong J.W., Fehniger T.A. Utilizing Cytokines to Function-Enable Human NK Cells for the Immunotherapy of Cancer. Scientifica (Cairo) 2014;2014:205796. DOI: 10.1155/2014/205796.Park J.Y., Keller H., Sato N., Park J.H. NKT cells require IL-7, not IL-15, for survival and homeostasis. J Immunol 2014;192(1 Supplement):65.18.Zhu L., Xie X., Zhang L. et al. TBKbinding protein 1 regulates IL-15- induced autophagy and NKT cell survival. Nat Commun 2018;9(1):2812. DOI: 10.1038/s41467-018-05097-5.Song Y., Liu Y., Hu R. et al. In vivo antitumor Activity of a Recombinant IL-7/IL-15 Hybrid Cytokine in Mice. Mol Cancer Ther 2016;15(10):2413–21. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0111Park J.Y., Keller H., Sato N., Park J.H. NKT cells require IL-7, not IL-15, for survival and homeostasis. J Immunol 2014;192(1 Supplement):65.18.Song Y., Liu Y., Hu R. et al. In vivo antitumor Activity of a Recombinant IL-7/IL-15 Hybrid Cytokine in Mice. Mol Cancer Ther 2016;15(10):2413–21. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0111