Introduction. The introducing of tumor molecular profiling into clinical practice has revealed the need for development of new analytical methods for estimating marker expression in solid tumors, as routinely used method of immunohistochemistry has a number of significant drawbacks.
Objective. Analytical validation of immunofluorescence staining and flow cytometry method developed by the authors for the examination of tumor protein markers in the solid tumors tissue.
Materials and methods. Method validation was carried out by quantitative estimation of βIII-tubulin (TUBB3) expression in single-cell suspensions of non-small-cell lung cancer obtained from surgical tumor samples. Primary antibodies to TUBB3 (ab7751) and secondary DyLight 650-conjugated antibodies (ab98729) were used for immunofluorescent staining. The «Navios» flow cytometer (Beckman Coulter) was used to measure the fluorescence. The validation parameters were assessed by the coefficient of variation calculated as the ratio of standard deviation of TUBB3 level to its mean value.
Results. Two parameters were analyzed: intra-assay precision and time stability of the results of the TUBB3 expression assessment. It was demonstrated that the mean coefficients of variation of the marker expression level in the tumor tissue did not exceed 20 % for both parameters. According to recommendations on the analytical validation of methods based on flow cytometry, it proves the validity of the method for these parameters.
Conclusions. The intra-assay precision and time stability were demonstrated for the results of a quantitative estimation of TUBB3 expression in solid tumor tissue using immunofluorescence staining and flow cytometry method developed by the authors. The practical value of the time stability of immunofluorescence stain during 24 h storage of a stained cells suspension in the dark at 4 °C was highlighted. It shows the possibility of adjusting the time interval between completion of the analytical study part and flow cytometer measurement.
Введение. Введение в клиническую практику молекулярного фенотипирования опухолей продемонстрировало необходимость создания новых аналитических методов оценки экспрессии маркёров в сóлидных новообразованиях, поскольку рутинно используемый метод иммуногистохимии характеризуется рядом существенных недостатков.
Цель исследования – аналитическая валидация разработанного авторами иммунофлуоресцентного метода, ассоциированного с проточной цитометрией, для изучения опухолевых белковых маркёров в ткани сóлидных новообразований.
Материалы и методы. Валидация метода проведена при количественной оценке экспрессии белка βIII-тубулина (TUBB3) в суспензиях клеток немелкоклеточного рака легкого, полученных из хирургических образцов опухоли. Для иммунофлуоресцентного окрашивания использованы первичные антитела к TUBB3 (ab7751) и вторичные – конъюгированные с красителем DyLight 650 (ab98729). Для измерения флуоресценции клеток использовали проточный цитометр Navios (Beckman Coulter). Для оценки валидационных параметров использован коэффициент вариации, рассчитанный как отношение среднеквадратического отклонения уровня TUBB3 к его среднему значению.
Результаты. Проведен анализ 2 параметров: сходимости и временнóй стабильности результатов оценки экспрессии TUBB3. Показано, что средний коэффициент вариации уровня экспрессии исследованного маркёра в ткани опухоли при оценке сходимости и стабильности иммунофлуоресцентной окраски не превысил 20 %. Согласно рекомендациям по аналитической валидации методов, основанных на использовании проточного цитометра, это доказывает валидность метода по исследованным параметрам.
Заключение. Показана сходимость и временнáя стабильность результатов количественной оценки экспрессии прогностически и предиктивно значимого белка TUBB3 в ткани сóлидных опухолей при использовании разработанного авторами метода иммунофлуоресцентного окрашивания, ассоциированного с проточной цитометрией. Отмечена практическая значимость факта временнóй стабильности иммунофлуоресцентной окраски при хранении суспензии окрашенных клеток в темноте при 4 °C в течение 24 ч, что указывает на возможность варьирования интервала времени от завершения аналитической части исследования до работы на проточном цитометре.