Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press115110.17650/1726-9784-2019-18-2-21-26ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИBRCa1 participates in XIST RNa localization on inactive x chromosomeBRCa1 участвует в локализации рнк XIST на неактивной х-хромосомеhttps://orcid.org/0000-0002-0158-4605ShestakovaE. A.ШестаковаЕ. А.
Russian Federation

24 Kashyrskoe Sh., Moscow 115478.

115478 Москва, Каширское шоссе, 24.

https://orcid.org/0000-0002-7673-4284BogushT. A.БогушТ. А.
Russian Federation

24 Kashyrskoe Sh., Moscow 115478.

115478 Москва, Каширское шоссе, 24.

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of Russia.ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России.1506201918221261406201914062019https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1151

Introduction . Inactive X chromosome (Xi) is associated with noncoding XIST RNA, series of proteins and contains multiple epigenetic modifications that altogether determine a silence of the most of X-linked genes. Recently the data were obtained that tumor suppressor BRCA1 is also associated with Xi. The purpose of this study was to reveal the colocalization of BRCA1 and XIST RNA and precise spatial organization on Xi with the high resolution of confocal microscopy.

Materials and methods . The object of the study is IMR90hTERT diploid immortalized fibroblast cell line. For BRCA1 and XIST RNA colocalization analysis on Xi the method of fluorescent hybridization in situ associated with immunofluorescent cell staining (immunoFISH) and confocal microscopy were used. For BRCA1 and heterochromatin protein-1 colocalization study the method of double immunofluorescent staining and common fluorescent microscopy were applied.

Results . The study using confocal fluorescent microscopy with higher resolution has demonstrated at first the colocalization of BRCA1 with XIST RNA region of Xi revealed with XIST RNA probes and with replicating Xi and autosomes revealed with BrdU in late S-phase of cell cycle. Altogether, the data obtained suggest the involvement of BRCA1 in the inhibition of gene expression on Xi due to the regulation of XIST RNA association with Xi. Moreover, according to the results of confocal microscopy, BRCA1 also colocalizes with replicating Xi and autosomes revealed with BrdU in late S-phase of cell cycle. This indicates a possible involvement of this protein in the replication of pericentromeric repeats in cellular chromosomes. Colocalization of BRCA1 with heterochromatin protein-1α presented in pericentromeric regions of all chromosomes supports this suggestion.

Conclusions . Altogether, the data obtained in this study suggest the involvement of BRCA1 in the inhibition of gene expression on Xi due to the association with noncoding inhibiting XIST RNA and in replication of heterochromatin regions. 

Введение . Инактивированная Х-хромосома (Xi) ассоциирована с некодирующей РНК XIST, с целым рядом белков и содержит многочисленные эпигенетические модификации хроматина, что приводит к ингибированию экспрессии большинства генов на этой хромосоме. В последние годы были получены данные, свидетельствующие о том, что супрессор опухолей BRCA1 также взаимодействует с Xi. Цель исследования – выявить колокализацию BRCA1 и РНК XIST и детально проанализировать пространственную организацию BRCA1 и РНК XIST на Xi с помощью конфокальной микроскопии с высоким пространственным разрешением и контрастом.

Материалы и методы . Объектом исследования служили диплоидные иммортализованные фибробласты человека линии IMR90hTERT. Для локализации BRCA1 и РНК XIST на Xi использовали метод флуоресцентной гибридизации in situ, сопряженный с иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток, и конфокальную микроскопию. Для локализации BRCA1 и белков гетерохроматина-1 использовали метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток и традиционную флуоресцентную микроскопию.

Результаты . Впервые исследования, проведенные с использованием конфокальной микроскопии, продемонстрировали на более высоком уровне разрешения, чем было представлено в предыдущих работах, колокализацию BRCA1 с зоной РНК XIST на Xi, выявленную с зондами к РНК XIST. C помощью BrdU выявлена также локализация BRCA1 c реплицирующимися участками Xi и аутосомами в поздней S-фазе клеточного цикла. В целом приведенные данные позволяют предположить участие BRCA1 в ингибировании экспрессии генов на Xi, обусловленном влиянием BRCA1 на ассоциацию РНК XIST с Xi. Помимо этого, впервые с использованием конфокальной микроскопии выявлена колокализация BRCA1 с реплицирующимися Xi и аутосомами, идентифицированными с использованием BrdU, в поздней S-фазе клеточного цикла, что указывает на возможное участие этого белка в репликации перицентромерных повторов хромосом. В поддержку этой гипотезы также свидетельствуют данные о колокализации BRCA1 с белком гетерохроматина-1α, присутствующим в перицентромерных участках всех хромосом.

Заключение . Полученные данные указывают на участие BRCA1 в ингибировании экспрессии генов на Xi в результате регуляции ассоциации некодирующей ингибирующей РНК XIST с Xi, а также в репликации гетерохроматиновых участков хромосом.

BRCA1XIST RNAinactive Х chromosome (Xi)colocalizationconfocal microscopyBRCA1РНК XISTинактивированная Х-хромосома (Xi)колокализацияконфокальная микроскопияThis study was supported by grants from the National Cancer Institute (USA), Breast Cancer Research Foundation (USA), Novartis Institute for Biomedical Research (USA) issued to Professor David M. Livingston.Представленное исследование поддержано грантами Национального института онкологических исследований (США), Фонда по исследованиям в области рака молочной железы (США), Института по биомедицинским исследованиям (США), выданными проф. Дэвиду М. Ливингстону (Pr. D. M. Livingston).1. Jegu T., Aeby E., Lee J.T. the X chromosome in space. Nat Rev Genet 2017;18(6): 377–89. DOI: 10.1038/nrg.2017.17.Jegu T., Aeby E., Lee J.T. the X chromosome in space. Nat Rev Genet 2017;18(6): 377–89. DOI: 10.1038/nrg.2017.17.2. Yang. L., Froberg J., Lee J.T. Long noncoding RNAs: fresh perspectives into the RNA world. Trends Biochem Sci 2014;39(1):35–43. DOI: 10.1016/j.tibs.2013.10.002.Yang. L., Froberg J., Lee J.T. Long noncoding RNAs: fresh perspectives into the RNA world. Trends Biochem Sci 2014;39(1):35–43. DOI: 10.1016/j.tibs.2013.10.002.3. Heard E. Recent advances in X-chromosome inactivation. Curr Opin Cell Biol 2004;16(3):247–55. DOI: 10.1016/j.ceb.2004.03.005.Heard E. Recent advances in X-chromosome inactivation. Curr Opin Cell Biol 2004;16(3):247–55. DOI: 10.1016/j.ceb.2004.03.005.4. Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(50):17450–5. DOI: 10.1073/pnas.0408021101.Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(50):17450–5. DOI: 10.1073/pnas.0408021101.5. Chadwick B.P., Lane T.F. BRCA1 associates with the inactive X chromosome in late S-phase, coupled with transient H2AX phosphorylation. Chromosoma 2005;114(6):432–9. DOI: 10.1007/s00412-005-0029-1.Chadwick B.P., Lane T.F. BRCA1 associates with the inactive X chromosome in late S-phase, coupled with transient H2AX phosphorylation. Chromosoma 2005;114(6):432–9. DOI: 10.1007/s00412-005-0029-1.6. Pageau G.J., Lawrence J.B. BRCA1 foci in normal S-phase nuclei are linked to interphase centromeres and replication of pericentric heterochromatin. J Cell Biol 2006;175(5):693–701. DOI: 10.1083/jcb.200602055.Pageau G.J., Lawrence J.B. BRCA1 foci in normal S-phase nuclei are linked to interphase centromeres and replication of pericentric heterochromatin. J Cell Biol 2006;175(5):693–701. DOI: 10.1083/jcb.200602055.7. Ganesan S.C., Silver D.P., Greenberg R.A. et al. BRCA1 supports XIST RNA concentration on the inactive X chromosome. Cell 2002;111(3):393–405.Ganesan S.C., Silver D.P., Greenberg R.A. et al. BRCA1 supports XIST RNA concentration on the inactive X chromosome. Cell 2002;111(3):393–405.8. Silver D.P., Dimitrov S.D., Feunteun J. et al. Further evidence for BRCA1 communication with the inactive X chromosome. Cell 2007;128(5):991– 1002. DOI: 10.1016/j.cell.2007.02.025.Silver D.P., Dimitrov S.D., Feunteun J. et al. Further evidence for BRCA1 communication with the inactive X chromosome. Cell 2007;128(5):991– 1002. DOI: 10.1016/j.cell.2007.02.025.9. Shestakova E.A. Epigenetic regulation of BRCA1 expression and its role in breast cancer stem cell development. Turk J Biol 2016;40(5):981–9. DOI: 10.3906/biy-1507-145.Shestakova E.A. Epigenetic regulation of BRCA1 expression and its role in breast cancer stem cell development. Turk J Biol 2016;40(5):981–9. DOI: 10.3906/biy-1507-145.10. Богуш Т.А., Шестакова Е.А., Вихлянцева Н.О. и др. Эпигенетические механизмы регуляции BRCA1. Онкогинекология 2017;23(2):4–11. [Bogush T.A., Shestakova E.A., Vikhlyantseva N.O. et al. Epigenetic mechanisms of BRCA1 regulation. Onkoginekologiya = Oncogynecology 2017;23(2):4–11. (In Russ.)].Богуш Т.А., Шестакова Е.А., Вихлянцева Н.О. и др. Эпигенетические механизмы регуляции BRCA1. Онкогинекология 2017;23(2):4–11. [Bogush T.A., Shestakova E.A., Vikhlyantseva N.O. et al. Epigenetic mechanisms of BRCA1 regulation. Onkoginekologiya = Oncogynecology 2017;23(2):4–11. (In Russ.)].11. Robert-Fortel I., Junera H.R., Geraud G. et al. Three-dimentional organization of the ribosomal genes and Ag-NOR proteins during interphase and mitosis in PtK1 cells studied by confocal microscopy. Chromosoma 1993;102(3):146–57.Robert-Fortel I., Junera H.R., Geraud G. et al. Three-dimentional organization of the ribosomal genes and Ag-NOR proteins during interphase and mitosis in PtK1 cells studied by confocal microscopy. Chromosoma 1993;102(3):146–57.