Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press111810.17650/1726-9784-2018-17-1-83-94ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИScaling of the technology of obtaining the hydroxyaluminium tetra-3-phenylthiophthalocyanine liposomal form and studying its mutagenic and immunotoxic propertiesМасштабирование технологии получения липосомальной формы тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия и изучение ее мутагенных и иммунотоксических свойствLantsovaA. V.ЛанцоваА. В.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

NikolaevaL. L.НиколаеваЛ. Л.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Людмила Леонидовна Николаева 

alima91@yandex.ruOborotovaN. A.ОборотоваН. А.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

SanarovaE. V.СанароваЕ. В.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

OrlovaO. L.ОрловаО. Л.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

GolubtsovaN. V.ГолубцоваН. В.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

RudakovaA. A.РудаковаА. А.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

SokolovaZ. A.СоколоваЗ. А.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

KirsanovK. I.КирсановК. И.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

LesovayaE. A.ЛесоваяЕ. А.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

TilovaL. R.ТиловаЛ. Р.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of RussiaФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России27022018171839427112018271120182018https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1118

The use of liposomes as drug delivery systems today is a recognized approach to improving the effectiveness of treatment. Compared with other nanosized carriers, liposomes are highly biocompatible. However, in the literature, there are a number of data on the immunogenicity of some liposomal drugs. Hypersensitivity reactions of moderate to severe severity were noted in some patients with intravenous administration of liposomes Doxil®, Ambisome®, DaunoХome®. The technology of production of liposomes is a laborious process and obtaining liposomal forms on an industrial scale is problematic for researchers and manufacturers around the world. In connection with this, studies on the scaling up of technology for obtaining liposomes and studying the specific toxicity of liposomal preparations are relevant. Objective – evaluation of the quality of prototypes of liposomal dosage form based on tetra-3-phenylthiophthalocyanine hydroxyaluminum obtained by scaled technology in comparison with samples produced in laboratory conditions, as well as studying their mutagenic and immunotoxic properties. Object of the study – tetra-3-phenylthiophthalocyanine hydroxyaluminum liposomal, lyophilizate for the preparation of injection for injection of 1,5 mg, in bottles with a capacity of 20 ml (LLF). Materials and methods. Bengem’s method, extrusion, sterilizing filtration, lyophilization, intercellular contact integrity test (for promoter activity), Ames bacterial test, cytogenetic study of chromosomal aberrations, DNA damage test (DNA comet test), Erne method; hypersensitivity reaction of delayed type, determination of mass and cellness of central and peripheral immunity organs, evaluation of phagocytic activity of peritoneal macrophages. Results. Based on the results of the research, the LLF production technology is scaled, which allows obtaining up to 400 LLF flasks per production cycle. It has been established that LLF at doses of 6 and 24 mg/kg does not cause an increase in the number of chromosomal abnormalities in mice and does not cause DNA damage, in doses of 1,1–22,0 μg/dish LLF does not show mutagenic activity in the Ames bacterial test, in the range concentrations of 0,062–3,1 μg in the test for promoter activity does not separate intercellular contacts. It is determined that in doses of 6 and 12 mg/kg, LLF does not affect humoral and cellular immunity, does not change the mass and cellularity of the central and peripheral organs of the immune system. LLF, 24 hours after administration at doses of 6 and 12 mg/kg, dose-dependently decreases the phagocytic activity of peritoneal macrophages, which is restored after 7 days. Conclusion. The technology of LLF production is scaled. In the doses studied, it was found that LLF does not have the ability to promote the process of carcinogenesis and the lack of influence on the humoral and cellular immune response.

Применение липосом в качестве систем доставки лекарственных средств в организм человека сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения. По сравнению с другими наноразмерными носителями липосомы отличаются высокой биосовместимостью. Однако в литературных источниках имеется ряд данных об иммуногенности некоторых липосомальных препаратов. Проявления реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степени отмечены у части пациентов при внутривенном введении липосом Doxil®, Ambisome®, DaunoХome®. Технология производства липосом – достаточно трудоемкий процесс, поэтому получение липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) в промышленных масштабах для проведения доклинических и клинических исследований проблематично для исследователей и производителей всего мира. В связи с этим актуальным представляется проведение исследований специфической токсичности липосомальных препаратов и масштабирования технологии получения липосом. Цель исследования – оценка качества опытных образцов ЛЛФ на основе тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, полученных по масштабированной технологии, в сравнении с образцами, произведенными в лабораторных условиях, а также изучение их мутагенных и иммунотоксических свойств. Объект исследования – тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг, во флаконах вместимостью 20 мл. Материалы и методы. В работе использовались метод Бенгема, экструзия, стерилизующая фильтрация, лиофилизация; тест на нарушение целостности межклеточных контактов (на промоторную активность), бактериальный тест Эймса, цитогенетическое исследование по учету хромосомных аберраций, тест на способность вызывать повреждение ДНК (тест ДНК-комет), метод Ерне; реакция гиперчувствительности замедленного типа, определение массы и клеточности центральных и периферических органов иммунитета, оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Результаты. По результатам проведенных исследований масштабирована технология получения ЛЛФ, позволяющая получать до 400 флаконов ЛЛФ за один производственный цикл. Установлено, что ЛЛФ в дозах 6 и 24 мг/кг не увеличивает количество хромосомных аномалий у мышей и не вызывает повреждений ДНК, в дозах 1,1–22,0 мкг/чашка не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса, в диапазоне концентраций 0,062–3,1 мкг в тесте на промоторную активность не разобщает межклеточные контакты. Определено, что ЛЛФ в дозах 6 и 12 мг/кг при 1-кратном внутривенном введении не оказывает влияния на гуморальный и клеточный иммунные ответы, не изменяет массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы. ЛЛФ через 24 ч после введения в дозах 6 и 12 мг/кг дозозависимо снижает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, которая восстанавливается через 7 сут. Заключение. Масштабирована технология получения ЛЛФ. В исследуемых дозах установлено отсутствие у ЛЛФ способности промотировать процесс канцерогенеза и влиять на гуморальный и клеточный иммунные ответы.

hydroxyaluminium tetra-3-phenylthiophthalocyanine liposomal formproduction scalingmutagenic propertiesimmunotoxicityлипосомальная лекарственная форма тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминиямасштабирование производствамутагенные свойстваиммунотоксичность1.Maeda H.,WuJ.,Sawa T.et al.Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Rel 2000; 65:271–84. doi:10.1016/S0168-3659(99)00248-5.Maeda H.,WuJ.,Sawa T.et al.Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Rel 2000; 65:271–84. doi:10.1016/S0168-3659(99)00248-5.2.Wick P.,Manser P.,Limbach L.K.et al. The degree and kind of agglomeration affect carbon nanotube cytotoxicity. Toxicol Lett 2007; 168(2):121–31. doi:10.1016/j.toxlet.2006.08.019.Wick P.,Manser P.,Limbach L.K.et al. The degree and kind of agglomeration affect carbon nanotube cytotoxicity. Toxicol Lett 2007; 168(2):121–31. doi:10.1016/j.toxlet.2006.08.019.3.Ziemba B.,Matuszko G., Bryszewska M.,Klajnert B. Influence of dendrimers on red blood cells. Cell Moll Biol Lett 2012; 17(1):21–35. doi:10.2478/s11658-011-0033-9.Ziemba B.,Matuszko G., Bryszewska M.,Klajnert B. Influence of dendrimers on red blood cells. Cell Moll Biol Lett 2012; 17(1):21–35. doi:10.2478/s11658-011-0033-9.4.Аляутдин Р.Н.,Романов Б.К. Рекомендации по оценке безопасности лекарственных средств,содержащих наночастицы. Безопасность и риск фармакотерапии 2015; 4:10–22.Аляутдин Р.Н.,Романов Б.К. Рекомендации по оценке безопасности лекарственных средств,содержащих наночастицы. Безопасность и риск фармакотерапии 2015; 4:10–22.5.Szebeni J.,Muggia F.,Gabizon A., Barenholz Y.Activation of complement by therapeutic liposomes and other lipid excipient-based therapeutic products: prediction and prevention. Adv Drug Deliv Rev 2011;63(12):1020–30. doi:10.1016/j.addr.2011.06.017.Szebeni J.,Muggia F.,Gabizon A., Barenholz Y.Activation of complement by therapeutic liposomes and other lipid excipient-based therapeutic products: prediction and prevention. Adv Drug Deliv Rev 2011;63(12):1020–30. doi:10.1016/j.addr.2011.06.017.6.Brissette J.L.,Kumar N.M.,Gilula N.B., Dotto G.P. The tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and the ras oncogene modulate expression and phosphorylation of gap junction proteins. Mol Cell Biol 1991; 11:5364–71.Brissette J.L.,Kumar N.M.,Gilula N.B., Dotto G.P. The tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and the ras oncogene modulate expression and phosphorylation of gap junction proteins. Mol Cell Biol 1991; 11:5364–71.7.Abbaci M.,Barberi-Heyob M.,Blondel W. et al. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication .BioTechniques 2008; 45:33–46. doi:10.1128/MCB.11.10.5364.Abbaci M.,Barberi-Heyob M.,Blondel W. et al. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication .BioTechniques 2008; 45:33–46. doi:10.1128/MCB.11.10.5364.8.Na M.R.,Koo S.K.,Kimd.Y. et al.In vitro inhibition of gap junctional intercellular communication by chemical carcinogens. Toxicology 1995; 98:199–206. doi:10.1016/0300-483X(94)02931-J.Na M.R.,Koo S.K.,Kimd.Y. et al.In vitro inhibition of gap junctional intercellular communication by chemical carcinogens. Toxicology 1995; 98:199–206. doi:10.1016/0300-483X(94)02931-J.9.Maron D.M.,Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983;113(3–4):173–215. doi:10.1016/0165-1161(83)90010-9.Maron D.M.,Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983;113(3–4):173–215. doi:10.1016/0165-1161(83)90010-9.10.Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических препаратов. М.: ГрифиК, 2012. Ч.1. 944с.Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических препаратов. М.: ГрифиК, 2012. Ч.1. 944с.11.Белицкий Г.А.,Ревазова Ю.А., Абилев С.К. и др. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Ведомости Фармакологического комитета 1998; 1:21–4.Белицкий Г.А.,Ревазова Ю.А., Абилев С.К. и др. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Ведомости Фармакологического комитета 1998; 1:21–4.12.Фонштейн Л.М.,Абелев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды спомощью бактeриальных тест-систем (Методические указания). М.,1983.34с.Фонштейн Л.М.,Абелев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды спомощью бактeриальных тест-систем (Методические указания). М.,1983.34с.13.Ford C.E.,Hamerton J .L. Chromosomes of five rodent species. Nature 1956; 31:247–54.Ford C.E.,Hamerton J .L. Chromosomes of five rodent species. Nature 1956; 31:247–54.14.Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,2010.Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,2010.15.Olive P.L.,Banath J.P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc 2006; 1(1):23–9. doi:10.1038/nprot.2006.5.Olive P.L.,Banath J.P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc 2006; 1(1):23–9. doi:10.1038/nprot.2006.5.16.Budunova I.V., Mittelman L.A., Belitsky G.A. Identification of tumor promoters by their inhibitory effect on intercellular transfer of lucifer yellow. Cell Biol Toxico l1989;5(1):77–89. doi:10.1007/BF00141066.Budunova I.V., Mittelman L.A., Belitsky G.A. Identification of tumor promoters by their inhibitory effect on intercellular transfer of lucifer yellow. Cell Biol Toxico l1989;5(1):77–89. doi:10.1007/BF00141066.17.Ostling O.,Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984;123:291–8. doi:10.1016/0006-291X(84)90411-X.Ostling O.,Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984;123:291–8. doi:10.1016/0006-291X(84)90411-X.18.Иванова А.С.,Мастернак Т.Б., Мартынов А.И. Принципы изучения иммунотоксического действия фарма кологических препаратов. Токсикологический вестник 2010;5:26–31.Иванова А.С.,Мастернак Т.Б., Мартынов А.И. Принципы изучения иммунотоксического действия фарма кологических препаратов. Токсикологический вестник 2010;5:26–31.19.Иванова А.С.,Мастернак Т.Б.,Малкина Е.Ю., Мартынов А.И. Принципы оценки иммунологической безопасности фармацевтических продуктов. Биомедицина 2011;(3):94–7.Иванова А.С.,Мастернак Т.Б.,Малкина Е.Ю., Мартынов А.И. Принципы оценки иммунологической безопасности фармацевтических продуктов. Биомедицина 2011;(3):94–7.20.Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 1963;140:405.Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 1963;140:405.21.Подоплелов И.И.,Крылов О.Р., Медуницын Н.В. Эванс синий как адъювант для получения повышенной чувствительности замедленного типа в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1985;6:729.Подоплелов И.И.,Крылов О.Р., Медуницын Н.В. Эванс синий как адъювант для получения повышенной чувствительности замедленного типа в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1985;6:729.22.Raz A.,Bucana C.,Fogler W.E.et al. Biochemical,Morphological,and Ultrastructural Studies on the Uptake of Liposomes by Murine Macrophages. Cancer Res 1981;41:487–94.PMID:7448797.Raz A.,Bucana C.,Fogler W.E.et al. Biochemical,Morphological,and Ultrastructural Studies on the Uptake of Liposomes by Murine Macrophages. Cancer Res 1981;41:487–94.PMID:7448797.