24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478
115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Марина Евгеньевна Копырулина
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478
115478 Москва, Каширское шоссе, 24
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478
115478 Москва, Каширское шоссе, 24
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478
115478 Москва, Каширское шоссе, 24
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478
115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Fluorescent probes based on monoclonal antibodies (MAb) are widely used in scientific and clinical research in the field of oncology, hematology, immunology, epidemiology. Objective: to create of fluorescent probes based on the MAb and the fluorescent dye Alexa-488 for the analysis of cellular populations by flow cytometry. Materials and methods. MAb to B lymphocyte antigen (clone ICO-180), fluorescent dye Alexa-488 were used in the work. MAb was isolated from ascitic fluid by combined purification of the immunoglobulin fraction with caprylic acid and salting out with ammonium sulfate. Gel filtration on a PD-10 column was used to purify the conjugates (immunofluorescent probes, IFP), the concentration and labeling density of the IFP were determined spectrophotometrically. The determination of the working titer of the IFP was performed using the antibody titration method proposed by C.C. Stewart. Results. The optimal time of incubation of MAb with a fluorophore was experimentally determined. The optimal conditions for labeling MAb of the IСO series with the dye are: a carbonate buffer with pH 8,3, the concentration of antibodies in the reaction mixture is 1 mg/ml, molar ratio of active dye – 10–100 mmol per 1 mmol of protein, the incubation time is 90 minutes, the temperature is 18–25 °C. We obtained a panel of conjugates of MAb with Alexa-488, differing in their different labeling densities. Evaluation of the biological activity of the resulting conjugates was carried out on peripheral blood cells of donors in the concentration range of MAb 0,5–100 μg/ml. Conclusion. The optimal conditions for labeling MAb of the IСO series with the dye are: a carbonate buffer with pH 8,3, the concentration of antibodies in the reaction mixture is 1 mg/ml, the incubation time is 90 minutes, the temperature is 18–25 °C. The optimum density of labeling is in the range 5–13,5 M:M, the optimal concentration of antibodies is in the range of 5–25 μg/ml.
Получение флуоресцентных зондов на основе моноклональных антител (МКА) к поверхностным антигенам лейкоцитов человека является актуальной задачей, решение которой даст возможность проводить научные и клинические исследования в области онкологии, гематологии, иммунологии, эпидемиологии. Цель исследования – создание флуоресцентных зондов на основе МКА и флуоресцентного красителя Alexa-488 для анализа клеточных популяций и субпопуляций лейкоцитов человека методом проточной цитометрии. Материалы и методы. В работе использовали МКА к антигену В-лимфоцитов (клон ИКО-180) и флуоресцентный краситель Alexa-488 в форме активного моносукцинимидного эфира. МКА выделяли из асцитной жидкости мышей с привитой внутрибрюшинно гибридомой путем комбинированной очистки иммуноглобулиновой фракции каприловой кислотой и высаливания сульфатом аммония. Для очистки полученных конъюгатов (иммунофлуоресцентных зондов, ИФЗ) применяли гель-фильтрацию на колонке PD-10, концентрацию и плотность мечения ИФЗ определяли спектрофотометрически. Оценку биологической активности полученных ИФЗ проводили с использованием клеток периферической крови доноров в диапазоне концентраций МКА 0,5–100 мкг/мл. Определение рабочего титра ИФЗ проводили по методу титрования антител, предложенному C.C. Stewart. Результаты. Экспериментально установлено оптимальное время инкубирования МКА с флуорофором. Получена панель ИФЗ с различной плотностью мечения Alexa-488. Для этого варьировали молярное соотношение МКА и флуорофора в среде реакции конъюгирования от 1:2 до 1:100. Оптимальная плотность мечения ИФЗ находится в диапазоне 5–13,5 М:М, концентрация антител – в диапазоне 5–25 мкг/мл. Для ИФЗ из МКА ИКО-180 с Alexa-488 такие высокие значения плотности мечения не приводят к снижению эффективности флуоресценции и антигенсвязывающей способности. Сравнительная характеристика специфической активности ИФЗ на основе МКА ИКО-180 и коммерческих ИФЗ (BD Biosciences) показала сопоставимые результаты. Заключение. Оптимальными условиями для мечения МКА ИКО-180 красителем являются: карбонатный буфер с рН 8,3, концентрация антител в реакционной смеси 1 мг/мл, количество активного красителя 10–100 ммоль на 1 ммоль белка,время инкубирования 90 мин при температуре 18–25 °С.