Russian Journal of BiotherapyRussian Journal of BiotherapyРоссийский биотерапевтический журнал1726-97841726-9792Publishing House ABV Press108710.17650/1726-9784-2018-17-2-47-56ORIGINAL REPORTSОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИMonoclonal antibodies of IKO series in the three-color analysis of sub-populations of peripheral blood T-lymphocytes of oncological patientsМоноклональные антитела серии ИКО в трехцветном анализе субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови онкологических больныхZakharovaE. N.ЗахароваЕ. Н.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

Елена Николаевна Захарова

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

zakharovaen@yandex.ruZabotinaT. N.ЗаботинаТ. Н.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

KorotkovaO. V.КоротковаО. В.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

KopyrulinaM. E.КопырулинаМ. Е.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

PanichenkoI. V.ПаниченкоИ. В.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

TsiklauriV. T.ЦиклауриВ. Т.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

ZadеrenkoI. A.ЗадеренкоИ. А.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

BlokhinD. Yu.БлохинД. Ю.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

IvanovP. K.ИвановП. К.
Russian Federation

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478

115478 Москва, Каширское шоссе, 24

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of RussiaФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России2411201817247562311201823112018https://bioterapevt.abvpress.ru/jour/article/view/1087

Background. Clinical studies have shown that the most oncological patients have impaired immunological reactivity. Monitoring of the immune system status of patients with solid tumors includes a subpopulation analysis of immunocompetent cells. It is based on the study of expression of surface antigens and intracellular structures, and an analysis of the functional activity of immunocompetent cells. Today two, three, and even four-color reagents are used for subpopulation analysis of lymphocytes. Fluorescent conjugate with monoclonal antibodies (MAB) of the ICO series and fluorescent dyes Imd-306, Imd-506 (cyanine) and phycoerythrin (a group of phycobiliproteins) was received and characterized in N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology. These conjugates have proved themselves in one and two-color analysis of subpopulations of peripheral blood lymphocytes by flow cytometry.

The purpose of this study is to assess the possibility of sharing several immunofluorescent probes (IFP) on the basis of different Mab series of ICO and dyes FITC, Imd306, Imd506 and PE for three-color analysis of lymphocyte subpopulations of donors and patients with oncological diseases by flow cytometry method.

Materials and methods. A panel of immunofluorescent probes (IFP) CD3FITC, CD4PE, CD8-Imd506, CD4-Imd306 was used in the work. Probes are obtained with MAB (ICO series) and fluorophores FITC, PE, Imd-306, Imd-506. The specific activity of the probes was evaluated in the immunofluorescence reaction by flow cytometry. Donor’s peripheral blood was used to optimize the conditions of the immunofluorescence reaction. Clinical approbation of the obtained sets was carried out on 2 groups of patients with oncological diseases before and after surgical treatment. The first group included 64 patients with cancer of the oral mucosa. The second group consists of 35 patients with ovarian cancer.

Results. We have shown that for the three-color analysis of human lymphocytes by flow cytometry, it is recommended to use sets of labeled MAB: CD3-FITC (10 μg/ml) + CD4-Imd306 at a concentration of 5–10 μg/ml; CD3-FITC + CD4-PE at a concentration of 20 μg/ml and CD3-FITC + CD8 Imd506 at a concentration of 10 μg/ml. The final concentration of immunoglobulin in the solution of IPS is indicated. It was shown that even before the beginning of treatment in patients with cancer of the oral mucosa the subpopulation CD3+ CD4+ content was significantly lowered in the structure of T cells, and the total level of CD8+ lymphocytes significantly exceeds the parameters of the donor group. Analysis of linear CD markers of lymphoid cells in patients with ovarian cancer revealed a significant decrease in the total number of CD3+ T-lymphocytes in comparison with donors. There was no evidence of the effect of surgical treatment on the subpopulation structure of lymphoid cells.

Conclusion. Combinations of fluorescent probes CD3-FITC/CD4-Imd306/CD8-Imd506 and CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Imd506 can be used for trichromatic analysis by flow cytometry of the lymphocyte subpopulations of both healthy donors and cancer patients. Comparative studies of the specific activity of combinations of IFP based on Mab ICO series and reference commercial test systems (BD Biosciences) on lymphocytes of healthy donors and oncological patients (ovarian cancer, oral mucosa cancer) showed comparable results. The application of the obtained probes made it possible to reveal violations of the subpopulation structure of peripheral blood lymphocytes in patients with ovarian cancer and cancer of the oral mucosa, in particular, CD3 – /CD8+, CD3+/CD4+, CD3+.

Введение. Клинические исследования показали, что у большинства онкологических больных наблюдаются нарушения иммунологической реактивности. Мониторинг состояния иммунной системы больных с солидными опухолями включает субпопуляционный анализ иммунокомпетентных клеток (ИКК), основанный на изучении экспрессии поверхностных антигенов и внутриклеточных структур, и анализ функциональной активности ИКК. В настоящее время для субпопуляционного анализа лимфоцитов человека используют двух-, трех- и даже четырехцветные реакции иммунофлуоресценции (РИФ), позволяющие одновременно определять в одном образце несколько различных антигенов. Для этого используют сбалансированные смеси («коктейли») иммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ) различной антигенной специфичности, несущих разную флуоресцентную метку. В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России путем конъюгирования моноклональных антител (МКА) серии ИКО и флуоресцентных красителей – флуоресцеина в форме изотиоцианатного эфира (FITC), моносукцинимидного эфира Alexa-488, цианиновых производных Imd306, Imd506 и растительного белка группы фикобилипротеинов фикоэритрина (PE) получены и охарактеризованы лабораторные образцы ИФЗ. Исследования этих конъюгатов показали их пригодность для одно- и двухцветного анализа субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека методом проточной цитометрии.

Цель исследования – оценить возможность совместного использования нескольких ИФЗ на основе различных МКА серии ИКО и красителей FITC, Imd306, Imd506 и PE для трехцветного анализа субпопопуляций лимфоцитов здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями методом проточной цитометрии.

Материалы и методы. В работе использовали панель ИФЗ, включающую зонды CD3-FITC, CD4-PE, CD8-Imd506, CD4-Imd306, полученные конъюгированием МКА серии ИКО разной специфичности и флуорофоров FITC, PE, Imd306 и Imd506 соответственно. Специфическую активность зондов оценивали в монохромных, двух- и трехцветных РИФ методом проточной цитометрии. Для оптимизации состава смесей ИФЗ и условий постановки РИФ в качестве исследуемого биологического материала использовали образцы венозной крови практически здоровых доноров. Клиническую апробацию полученных «коктейлей» проводили на 2 группах пациентов с онкологическими заболеваниями до и после хирургического лечения. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта. Вторая группа – 35 больных раком яичников.

Результаты. Показано, что для трехцветного анализа лимфоцитов человека методом проточной цитометрии рекомендуется использовать наборы меченых МКА: CD3-FITC (10 мкг/мл) + CD4-Imd306 с концентрацией 5–10 мкг/мл; CD3-FITC + CD4-PE с концентрацией 20 мкг/мл и CD3-FITC + CD8 Imd506 с концентрацией 10 мкг/мл. Указана конечная концентрация иммуноглобулина в растворе ИФЗ. Показано, что еще до начала лечения у больных раком слизистой оболочки полости рта в структуре Т-клеток статистически достоверно снижено содержание CD3+CD4+, а общий уровень CD8+ лимфоцитов достоверно превышает показатели донорской группы. Анализ линейных маркеров, характеризующих основную структуру лимфоидных клеток у первичных больных раком яичников, позволил выявить статистически значимое снижение по сравнению с показателями у доноров общего количества СD3+ Т-лимфоцитов. Не выявлено влияния проведенного хирургического лечения на показатели субпопуляционной структуры лимфоидных клеток.

Заключение. Комбинации флуоресцентных зондов CD3-FITC/CD4-Imd306/CD8-Imd506 и CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Imd506 могут использоваться для трехцветного анализа методом проточной цитометрии субпопуляций лимфоцитов как практически здоровых доноров, так и онкологических больных. Сравнительные исследования специфической активности комбинаций ИФЗ на основе МКА серии ИКО и референтных коммерческих тест-систем (BD Biosciences) на лимфоцитах здоровых доноров и онкологических больных (рак яичников, рак слизистой оболочки полости рта) показали сопоставимые результаты. Применение полученных зондов позволило выявить нарушения субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у больных раком яичников и раком слизистой оболочки полости рта, в частности CD3 – /CD8+, CD3+/CD4+, CD3+.

monoclonal antibodiesflow cytometryimmunofluorescent probesMAB conjugatesthree-color analysisмоноклональные антителаиммунофенотипированиепроточная цитометриятрехцветный анализиммунофлуоресцентные зондыGalaktionov V.G. Immunology: a textbook. Moscow: Publishing house of Moscow state University, 1998. 480 p. (In Russ.).Галактионов В.Г. Иммунология: учебник. М.: Издательство МГУ, 1998:480 с.Artamonova E.V. The role of immunophenotyping of tumor cells in the diagnosis and prognosis of breast cancer: dis. ... doctor of medicine: 14.01.12. Moscow, 2003. 311 p. (In Russ.)Артамонова Е.В. Роль иммунофено типирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы: дис. … д-ра мед. наук: 14.01.12. М., 2003:311 с.Borunova A.A., Chkadua G.Z., Zabotina T.N., Kadagidze Z.G. the Study of subpopulations of CD16+ lymphocytes in oncological patients on the background of vaccine therapy. Medical immunology 2006;8(2–3):334 (In Russ.)Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. Изучение субпопуляции CD16+ лимфоцитов у онкологических больных на фоне вакцинотерапии. Медицинская иммунология 2006;8(2–3):334.Borunova A.A., Chkadua G.Z., Zabotina T.N., Demidov L.V. Immunophenotype of lymphocytes of patients with melanoma against the background of vaccine therapy. The Russian biotherapeutic journal 2005;4(1):8 (In Russ.)Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Демидов Л.В. Иммунофенотип лимфоцитов больных меланомой на фоне вакцинотерапии. Российский биотерапевтический журнал 2005;4(1):8.Zabotina T.N., Ocheeva N.Yu., Korotkova O.V. et al. Evaluation of the functional activity of cells of the granulocyte-macrophage link of immunity in patients with cancer of the mucous membrane of the oral cavity. Materials of the VI Congress of oncologists and radiologists of CIS countries: thes. of rep. Dushanbe, 2010. P. 67–8 (In Russ.)Заботина Т.Н., Очеева Н.Ю., Короткова О.В. и др. Оценка функциональной активности клеток гранулоцитарно-макрофагального звена иммунитета больных раком слизистой оболочки полости рта. Мат-лы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ: тез. докл. Душанбе, 2010. С. 67–8.Zabotina T.N., Korotkova O.V., Borunova A.A. et al. Subpopulation structure of lymphocytes in patients with ovarian cancer. Vestnik RONC im. N.N. Blokhina = Bulletin of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center 2010;21(1):46–51 (In Russ.)Заботина Т.Н., Короткова О.В., Борунова А.А. и др. Субпопуляционная структура лимфоцитов у больных раком яичников. Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина 2010;21(1):46–51.Kadagidze Z.G., Slavina E.G., Zabotina T.N. et al. Immunological profile of blood lymphocytes in cancer patients. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2013;12(2):38 (In Russ.)Кадагидзе З.Г., Славина Е.Г., Заботина Т.Н. и др. Иммунологический профиль лимфоцитов крови у онкологических больных. Российский биотерапевтический журнал 2013;12(2):38.Kadagidze Z.G., Chertkova A.I., Zabotina T.N. et al. Basic subpopulations of regulatory lymphocytes in patients with malignant melanoma and breast cancer. Immunologiya = Immunology 2014;35(2):64–7 (In Russ.)Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Заботина Т.Н. и др. Основные субпопуляции регуляторных лимфоцитов у больных злокачественной меланомой и раком молочной железы. Иммунология 2014;35(2):64–7.Korovushkina K.A., Babaev A.A., Kotel’nikova T. V. et al. Assessment of immunity in tumors of the uterine body. Vestnik Nizhegorodskogo Universiteta im. N.I. Lobachevskogo = Bulletin of N.I. Lobachevsky Nizhny Novgorod University. 2010;2–2:653–8 (In Russ.)Коровушкина К.А., Бабаев А.А., Котельникова Т.В. и др. Оценка состояния иммунитета при опухолях тела матки. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2010;2–2:653–8.Korotkova O.V., Zabotina T.N., Skotarenko L.V. et al. Subpopulations of lymphocytes in the peripheral blood of patients with breast cancer. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2011;10(3):95 (In Russ.)Короткова О.В., Заботина Т.Н., Скотаренко Л.В. и др. Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных РМЖ. Российский биотерапевтический журнал 2011;10(3):95.Skotarenko L.V., Vorotnikov I.K., Kadagidze Z.G., Shamilov F.A. Features of T-cell immunity in breast cancer. Opukholi Zhenskoy Reproduktivnoy Sistemy = Tumors of the female reproductive system 2011;4:24–7 (In Russ.)Скотаренко Л.В., Воротников И.К., Кадагидзе З.Г., Шамилов Ф.А. Особенности Т-клеточного иммунитета при раке молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2011;4:24–7.Dubinkin I.V., Podgornaya T.V., Donskov S.I. Monoclonal reagents anti-A and anti-B with new properties. Transfuziologiya = Transfusion medicine 2009;10(1–2):28 (In Russ.)Дубинкин И.В., Подгорная Т.В., Донсков С.И. Моноклональные реагенты анти-А и анти-В с новыми свойствами. Трансфузиология 2009;10(1–2):28.Dubinkin I.V., Gorshkova T.V., Kalandarov R.S., Donskov S.I. Obtaining and testing of monoclonal anti-DVI-antibodies. Transfuziologiya = Transfusion medicine 2009;10(1–2):27–8 (In Russ.)Дубинкин И.В., Горшкова Т.В., Каландаров Р.С., Донсков С.И. Получение и испытание моноклональных анти DVI-антител. Трансфузиология 2009;10(1–2):27–28.Filatov A.V., Bachurin P.S., Markova N.A., Churakova N.E. A panel of monoclonal antibodies to antigens of human lymphocytes. Eksperimen tal’naya Onkologiya = Experimental Oncology 1989;11(2):29 (In Russ.)Филатов А.В., Бачурин П.С., Маркова Н.А., Сурнакова Н.Е. Панель моноклональных антител к антигенам человеческих лимфоцитов. Экспериментальная онкология 1989;11(2):29.Baryshnikov A.Yu., Frolova E.A., Leneva N.V. et al. Monoclonal antibodies ICO-105 to the in terleukin-2 receptor (antigen CD25). Vestnik RONC im. N.N. Blokhina = Bulletin of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center 1993;4(4):7–12 (In Russ.)Барышников А.Ю., Фролова Е.А., Ленева Н.В. и др. Моноклональные антитела ICO-105 к рецептору интерлейкина-2(антиген CD25). Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 1993;4(4):7–12.Queen A.M., Baryshnikov A.Yu., Vikha G.V. et al. Characteristics of monoclonal antibodies ICO-116 to the CD16 antigen on natural killer cells. Biotechnologiya = Biotechnology 1993;(11–12):61 (In Russ.)Королева А.М., Барышников А.Ю., Виха Г.В. и др. Характеристика моноклональных антител ICO-116 к антигену CD16 естественных киллеров. Биотехнология 1993;(11–12):61.Baryshnikov A.Yu., Blokhina N.G., Kadagidze Z.G. ICO-1 Monoclonal antibodies against the constant part of IA-like antigens. Eksperimental’naya Onkologiya = Experimental Oncology 1984;6:123 (In Russ.)Барышников А.Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе З.Г. Моноклональные антитела ИКО-1 против константной части IA-подобных антигенов. Экспериментальная онкология 1984;6:123.Zakharova E.N., Zabotina T.N., Chudinov A.V. et al. Two-color analysis of cell populations by flow cytometry meth using cyanide dye IMD-306. Materials of the all-Russian scientific-practical conference “Domestic anticancer drugs”: thes. of rep. Moscow, 2007. P. 66 (In Russ.)Захарова Е.Н., Заботина Т.Н., Чудинов А.В. и др. Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием цианинового красителя IMD-306. Мат-лы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты»: тез. докл. М., 2007. С. 66.Zakharova E.N., Ivanov P.K., Zabotina T.N. et al. Immunofluorescent probes based on ICO-31 monoclonal antibodies and IMD-506 cyanide dye for the analysis of cellular populations by flow cytometry. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2013; 12(4):27–32 (In Russ.)Захарова Е.Н., Иванов П.К., Заботина Т.Н. и др. Иммунофлуоресцентные зонды на основе моноклональных антител ICO-31 и цианинового красителя IMD-506 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический жунал 2013;12(4):27–32.Zakharova E.N., Ivanov P.K., Zabotina T.N. et al. Two-color analysis of cell populations by flow cytometry meth using ICO series MCA conjugated with cyanine dye IMD-306. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2014;13(1):17–21 (In Russ.)Захарова Е.Н., Иванов П.К., Заботина Т.Н. и др. Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием МКА серии ICO, конъюгированных с цианиновым красителем IMD-306. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):17–21.Kaparulina M.E., Zakharova E.N., Zabotina T.N. et al. Technology development and properties of immunofluorescence probes labeled Alexa-488 for the analysis of cell populations by flow cytometry. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(1):70–5 (In Russ.)Копырулина М.Е., Захарова Е.Н., Заботина Т.Н. и др. Технология создания и свойства иммунофлуоресценных зондов с меткой Alexa-488 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):70–5. DOI: 10.17650/1726978420181717075.Stewart C.C., Stewart S.J. Four colour compensation. Cytometry 1999;38(4):161–75. PMID: 10440854.