Features of expansion and immunophenotype of primary culture of human NK and NKT cells under the influence of various proliferation activators

Full Text

Введение

Одним из перспективных и активно развивающихся направлений иммунотерапии рака является создание и последующее введение пациенту генетически модифицированных натуральных киллеров (НК), популяция которых обладает выраженными естественными противоопухолевыми свойствами [1]. Генетические манипуляции с данными клетками необходимы для внедрения на их поверхность химерного рецептора антигена (CAR), который способен более эффективно распознавать опухолевые антигены и проводить активационный сигнал внутрь клетки-эффектора.

В настоящее время большинство доклинических разработок и клинических исследований посвящено созданию препаратов на основе CAR-Т-лимфоцитов, поскольку Т-клетки легко получить от пациента в большом количестве, а также потому, что данная клеточная популяция после активации обладает выраженной клональной экспансией [2]. Однако, несмотря на доказанную противоопухолевую активность CAR-T-клеток, CAR-T-терапия имеет ряд недостатков: это и длительное индивидуализированное производство, требующее высокотехнологического оснащения, и значительная стоимость препарата, и появление тяжелых побочных явлений при введении пациенту такого клеточного продукта [3].

Вследствие этого альтернативным источником иммунных клеток для CAR-терапии являются НК-клетки и натуральные киллеры Т-клетки (НКТ-клетки). Главным достоинством выбора НК-клеток для иммунотерапии является отсутствие системной токсичности CAR-НК-клеток. При их использовании не требуется подбор донора и реципиента по системе главного лейкоцитарного антигена человека (HLA), так как инфузия НК-клеток донора не вызывает реакции «трансплантат против хозяина» у реципиента [4]. НКТ-клетки для CAR-терапии используются предпочтительно благодаря следующим свойствам: выраженной цитотоксичности, осуществляемой посредством прямой цитотоксичности или активации αβT-клеток [5], снижению ингибирующей активности опухолеассоциированных макрофагов и миелоидных супрессорных клеток [6], а также отсутствию риска развития реакции «трансплантат против хозяина» ввиду возможности активации через рецепторы НК-клеток [7]. Так, CAR-НК- и CAR-НКТ-клетки могут быть изготовлены не «по запросу», а в плановом режиме массового производства, что снижает себестоимость препарата, делает его более доступным для лечения различных слоев населения, а также позволяет незамедлительно начать курс иммунотерапии после постановки диагноза [8].

Тем не менее разработка биомедицинских клеточных продуктов на основе CAR-НК- и CAR-НКТ-клеток, обладающих высокой противоопухолевой активностью, является сложным технологическим процессом. Главные задачи данного производства – это экспрессия CAR-рецептора на поверхности лимфоцитов, обогащение клеток, увеличение их цитотоксичности, а также минимизация контаминации Т-клетками. Экспансия НК- и НКТ-клеток ex vivo остается важной задачей при создании CAR-препарата, поскольку для иммунотерапии требуется введение пациенту больших доз модифицированных лимфоцитов. Вне зависимости от источника НК- и НКТ-клеток в организме человека невозможно сразу получить чистые клеточные популяции, поскольку они не существуют изолированно. Именно поэтому для обогащения НК- и НКТ-клеток и получения культуры, состоящей преимущественно из этих лимфоцитов, используются методы магнитной сепарации или сортировки клеток. Разделение клеточных популяций проводится до начала культивирования или является его конечным этапом [9]. Более предпочтительна сепарация на финальном этапе культивирования вследствие потенциально положительного воздействия других популяций лимфоцитов на НК-клетки при сокультивировании, однако нельзя исключать и взаимное ингибирование между популяциями. Целенаправленное культивирование НК в присутствии других иммунных клеток, которые в данном случае называются аутологичными фидерными клетками, является одним из подходов к стимуляции пролиферации НК- и НКТ-клеток и поддержанию их функциональной активности посредством секреции провоспалительных цитокинов и прямого межклеточного взаимодействия [10].

Длительность культивирования НК- и НКТ-клеток зависит от конкретной методики и колеблется от 7 до 21 дня. Вне зависимости от наличия или отсутствия разделения популяций в начале культивирования иммунные клетки проходят этап активации. Наиболее часто для экспансии НК-клеток используют моноклональные антитела (МАТ) к CD (cluster of differentiation) 3- и CD28-рецепторам [11]. Такой способ стимуляции пролиферации может оказаться достаточно эффективным для обогащения популяции НКТ-клеток, поскольку они наряду с Т-лимфоцитами экспрессируют Т-клеточный рецептор. Однако при использовании МАТ для активации первичной культуры лимфоцитов без разделения клеточных популяций происходит соактивация Т-лимфоцитов, которые обладают более выраженной пролиферативной активностью [12], поэтому при использовании такого подхода этап разделения клеточных популяций является необходимостью.

Другими хорошо изученными Т-клеточными митогенами являются L-фитогемагглютинин (L-PHA) и конканавалин А (Con-A) [13]. L-PHA представляет собой лектин, полученный из красной фасоли, который связывается с рецепторами на поверхности Т-клеток и стимулирует метаболическую активность и деление клеток [14]. Con-A также является лектином, но экстрагированным из семян Canavalia ensiformis и способным избирательно стимулировать Т-лимфоциты [15]. Оба указанных лектина активируют Т-клетки не только посредством классической активации через Т-клеточный рецептор, но и взаимодействуя с иными рецепторами клеточной мембраны [16].

Перспективным, но малоизученным направлением на данный момент представляется in vitro активация иммунных клеток фукозилированным хондроитинсульфатом (FCS) – полисахаридом, выделенным из морского огурца Cucumaria japonica [17–22].

Цель данного исследования – выявление оптимального способа активации НК- и НКТ-клеток в первичной культуре мононуклеарных клеток (МНК): МАТ к CD3- и CD28-рецепторам, L-PHA, Con-A, а также комбинации МАТ к CD3- и CD28-рецепторам и FCS. Действие активаторов оценивали по показателям цитотоксичности по отношению к опухолевым клеткам, пролиферативной активности и экспрессии активационных маркеров.

Материалы и методы

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата

Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови и лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата проводили с использованием метода седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколла (р = 1,077 г/см³). Кровь из пробирок, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту, разводили в 2 раза раствором Хенкса («ПанЭко», Россия). При выделении клеток из лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата его центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре (23 ºC), отбирали лейкоцитарный слой и разводили его раствором Хенкса в 3 раза. Затем, вне зависимости от источника МНК, образцы наслаивали на 1,5 мл фиколла (Ficoll Paque, GE Healthcare, США) и центрифугировали в течение 25 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре (23 ºC). Отбирали слой МНК и проводили 3-кратную отмывку раствором Хенкса, центрифугируя в течение 5 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре (23 ºC), отбирая после этого надосадочную жидкость. После этого проводили подсчет живых клеток с использованием красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия) в автоматическом счетчике клеток Luna II (Logos biosystems, Республика Корея). Показатель жизнеспособности > 90% считали удовлетворительным. Клетки доводили до рабочей концентрации 3,5–4 × 10⁶/мл с помощью питательной среды DMEM (Dullbecco’s modified Eagle’s medium), содержащей 4,5 г/л глюкозы («ПанЭко», Россия), а также 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone, США), пенициллин-стрептомицин («ПанЭко», Россия). После этого свежевыделенные МНК подвергали активации.

Сорбция моноклональных антител для последующей активации мононуклеарных клеток

Для активации МНК использовали МАТ к CD3- и CD28-рецепторам (BioLegend, США) в различных концентрациях: от 1 до 10 мкг/мл для анти-CD3-антител и от 2 до 20 мкг/мл – для анти-CD28-антител. Соотношение анти-CD3-антител к анти-CD28-антителам всегда составляло 1 к 2. Для достижения заданной концентрации антител изготовляли их растворы в стерильном фосфатном буферном солевом растворе (PBS) и добавляли по 1 мл/лунка в стерильный 12-луночный культуральный планшет (SPL life Sciences, Республика Корея). Планшеты инкубировали в течение 5 ч при температуре 37 ºC в СО₂-инкубаторе модели SCO5A (Sheldon Manufacturing Inc, США) и проводили последующую 3-кратную отмывку от несвязавшихся антител с помощью 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (Sigma, Roedermark, Германия) в PBS.

Активация свежевыделенных мононуклеарных клеток

При активации МАТ суспензию МНК вносили к сорбированным антителам в концентрации 3,5– 4 × 10⁶/мл, после чего клетки инкубировали в течение 48 ч при температуре 37 ºC в СО₂-инкубаторе. В качестве активаторов также применяли L-PHA (Sigma, США), Con-A (Sigma, США) и FCS. FCS, использованный в настоящей работе, был выделен в результате экстракции суммы сульфатированных полисахаридов из голотурии дальневосточной Cucumaria japonica и последующего фракционирования с помощью анионообменной хроматографии. По данным химических и физико-химических методов анализа полисахарид содержит главную цепь из повторяющихся дисахаридных фрагментов [→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→]. В главной цепи сульфатированы по О-4 и О-6 остатки галактозамина и по О-3 (примерно на 33%) – остатки глюкуроновой кислоты. Остатки α-L-фукозы, преимущественно в виде 3,4- и 2,4-дисульфатированных звеньев в соотношении 4:1, присоединены в виде единичных боковых ответвлений в положения 3 остатков глюкуроновой кислоты главной цепи [17]. Для активации L-PHA или Con-A прибавляли к суспензии свежевыделенных МНК в диапазоне концентраций от 5 до 20 мкг/мл для L-PHA и от 2,5 до 15 мкг/мл для Con-A. Соинкубацию проводили в стерильных 12-луночных культуральных планшетах (SPL life Sciences, Республика Корея) в течение 48 ч в CO₂-инкубаторе при температуре 37 ºС. FCS-вещество прибавляли к суспензии свежевыделенных МНК в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл до 50 мкг/мл и суспензию клеток сразу вносили в лунки с сорбированными антителами.

Определение пролиферации клеток с помощью N-сукцинимидилового эфира 6-карбоксифлуоресцеина

Для оценки пролиферации клеток в 1-е сутки после активации проводили мечение клеток с помощью витального флуоресцентного красителя N-сукцинимидилового эфира 6-карбоксифлуоресцеина (CFSE, Invitrogen, США). Мечение МНК осуществляли непосредственно перед началом активации. Для этого клетки доводили до концентрации, составляющей от 0,5 × 10⁶/мл до 10 × 10⁷/мл. Затем к 1 мл клеточной суспензии добавляли 110 мкл CFSE, разведенного в 100 раз в PBS, и быстро перемешивали на вортексе. Клетки инкубировали в центрифужной пробирке на 15 мл (ApexLab, Россиия) при комнатной температуре (23 ºC) в течение 5 мин в темноте. Клетки отмывали 3 раза в 10 мл PBS c 5% FBS при центрифугировании в течение 5 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре и отбирали после этого надосадочную жидкость. Для определения интенсивности клеточного деления в качестве контроля использовали немеченые неактивированные клетки (естественная, минимальная флуоресценция) и меченые неактивированные клетки (максимальная флуоресценция). Дальнейшую оценку пролиферации проводили методом проточной цитометрии.

Культивирование лимфоцитов

Культивирование лимфоцитов проводили в течение 21 дня с момента выделения МНК. Клетки культивировали в 12- и 6-луночных культуральных планшетах (SPL life Sciences, Республика Корея) и культуральных флаконах 25 см² (SPL life Sciences, Республика Корея) в присутствии питательной среды DMEM c 4,5 г/л глюзозы, 10% FBS, 250–500 IU/мл человеческого рекомбинантного интерлейкина 2 (Xuri, Китай) при температуре 37 ºC в СО₂-инкубаторе. Перед подсчетом клеток с помощью световой микроскопии производили контроль морфологических характеристик лимфоцитов и визуальный контроль отсутствия микробной контаминации. С использованием трипанового синего и автоматического счетчика клеток проводили оценку жизнеспособности и количества культивируемых клеток. Показатель жизнеспособности > 90% считали удовлетворительным. Концентрацию клеток при культивировании поддерживали в диапазоне от 3 × 10⁵/мл до 1 × 10⁶/мл. Количество НК- и НКТ-клеток рассчитывали следующим образом: количество НК-клеток = общее количество культивируемых лимфоцитов × доля CD3 ^– CD56⁺-клеток; количество НКТ-клеток = общее количество культивируемых лимфоцитов × доля CD3⁺CD56⁺-клеток.

Ведение культур клеток

В работе использовали линию клеток Т47D HER2⁺, полученную из коллекции клеточных культур НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина. Линию Т47D HER2⁺ культивировали на среде DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% FBS и генетицин (0,4 мг/мл) («ПанЭко», Россия). Культуру клеток инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37 ºС.

Проточная цитофлуориметрия

Методом проточной цитофлуориметрии производили оценку пролиферации меченных CFSE клеток, а также анализ экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов. На этапе пробоподготовки живые клетки подсчитывали и доводили до концентрации 1 × 10⁶/мл. К 100 мкл клеток добавляли меченные флуорохромом МАТ в концентрациях, рекомендованных производителем. Инкубировали в течение 30 мин при температуре 4 ºС в холодильнике (Hitachi, Япония). Затем производили 3-кратную отмывку раствором PBS от несвязавшихся антител, центрифугируя 1500 об/мин в течение 5 мин при температуре 23 ºС и удаляя надосадочную жидкость. К осадку прибавляли 200 мкл PBS и раствор пропидия йодида до конечной концентрации 30 нг/мл (Sigma, США). Изучение экспрессии поверхностных маркеров осуществляли при использовании следующих МАТ: анти-CD3-PerCP (BD Pharmingen, США), анти-CD3-FITC (Beckman Coulter, США), анти-CD56-PE (Life Technologies, США), анти-CD (56⁺16) – PE (Beckman Coulter, США), анти-CD8-APC (Invitrogen, США), анти-CD4-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-APC (Invitrogen, США), анти-CD16-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-PE (BD Pharmingen, США), анти-CD25-APC (BD Pharmingen, США), анти-NKp30/CD337-PE (BD Pharmingen, США), анти-NKG2D/CD314-APC (BD Pharmingen, США), анти-CD38-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD69-PE (BD Pharmingen, США). Комбинацию меченных флуорохромами антител для обработки проб подбирали с учетом особенности диапазона детекции длины волны каждого флуорохрома. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Novocyte (ACEA Biosciences Inc, США) с использованием программного обеспечения Novo-Express 1.5.0. Погибшие клетки исключали из анализа по показателям рассеивания. Анализировали не менее 10 тыс. живых клеток.

Цитотоксический тест

Для оценки эффекторной функции культивируемых лимфоцитов применяли раствор резазурина в концентрации 5 мг/мл (Sigma-Aldrich, США). В качестве культуры-мишени использовали адгезионную культуру T47D-HER2⁺. Цитотоксический тест проводили в стерильных 96-луночных планшетах (SPL life Sciences, Республика Корея), в которые одномоментно вносили клетки-эффекторы и клетки-мишени в соотношении 5:1. При проведении цитотоксического теста концентрация клеток-мишеней составляла 0,5 × 10⁴ кл/лунку. В качестве отрицательного контроля мишеней использовали лунки, в которые вместо эффекторов вносили полную ростовую среду DMEM. В качестве отрицательного контроля эффекторов задействовали лунки, в которые вместо мишеней вносили полную ростовую среду DMEM. Конечный объем в каждой контрольной или экспериментальной лунке составлял 220 мкл. Каждая анализируемая точка имела 3 повтора. Затем планшет инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37 ºС в течение суток. На следующий день в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора резазурина аналогично протоколу АlamarBlue Cell Viability Reagent Product Information Sheet (Pub. No. MAN0018317 C.0). Затем планшет инкубировали в течение суток в CO₂-инкубаторе при температуре 37 ºС и измеряли интенсивность флуоресценции на мультирежимном планшетном ридере Spark (Tecan, Швейцария). Анализ проводили при длине возбуждения 560 нм и длине эмиссии 600 нм с использованием программного обеспечения Sparkcontrol v3.1. Цитотоксичность Х (%) оценивали по следующей формуле:

$Х=(1-((Э+М)-Э)/М)\times 100$,

где Э + М – среднее значение интенсивности флуоресценции для 3 аналогичных лунок, в которых находились клетки-эффекторы и клетки-мишени; Э – среднее значение интенсивности флуоресценции для 3 аналогичных лунок, в которых находились только клетки-эффекторы; М – среднее значение интенсивности флуоресценции для 3 аналогичных лунок, в которых находились только клетки-мишени.

Статистическая обработка данных

Результаты представлены по единичному донору и отражают средние значения для проведенной серии экспериментов. Данные экспериментов представлены как среднее значение ± SD. Результаты проанализированы с использованием программы Statistica 10. Тест ANOVA (two-way analysis of variance) с критерием Tukey HSD (honestly significant difference) использовали для оценки различий. Достоверными считали значения p < 0,05.

Результаты

Подбор оптимальных концентраций активаторов

Первоочередной задачей исследования был подбор рабочей концентрации анализируемых веществ. Результаты определения пролиферативной активности лимфоцитов на 5-е сутки после активации различными концентрациями анализируемых активаторов представлены на рис. 1. Наибольшей пролиферации клеток достигали при активации с использованием 2,5 мкг/мл анти-CD3, 5 мкг/мл анти-CD28/5 мкг/мл, L-PHA/5 мкг/мл Con-A. Для FCS оптимальная концентрация составляла 5 мкг/мл. В дальнейшем в работе использовали данные концентрации веществ. Увеличение воздействующих концентраций L-PHA или Con-A приводило к снижению эффективности стимуляции пролиферативного ответа лимфоцитов.

 

Рис. 1. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов на 5-е сутки после активации: а – моноклональные антитела (МАТ); б – МАТ + фукозилированный хондроитинсульфат (FCS); в – L-фитогемагглютинин (L-PHA); г – конканавалин А (Con-A)

Fig. 1. Proliferative activity dynamics of lymphocytes on the 5^th day after activation: а – monoclonal antibodies (mAbs); б – mAbs + fucosylated chondroitin sulfate (FCS); в – L-phytohemagglutinin (L-PHA); г – concanavalin A (Con-A)

 

Действие активаторов в первые дни после активации

Следующим этапом исследования являлось сравнение эффективности стимулирующего воздействия выбранных веществ на первичную культуру лимфоцитов в первые дни после активации. Детальное исследование влияния тестируемых активаторов на пролиферативную, цитотоксическую активность и иммунофенотип лимфоцитов позволило установить, что уже на 3-и сутки cоинкубации с активаторами пролиферативная активность лимфоцитов достоверно повышалась. Тем не менее, как видно из табл. 1, вне зависимости от способа активации статистически значимого различия в пролиферации лимфоцитов не наблюдали. В этот период отмечали достоверное повышение экспрессии активационных маркеров NKG2D, CD38, CD69 и CD25 (табл. 2) и снижение экспрессии NKp30-рецептора. Среди выбранных способов активации наименее выраженное снижение доли NKp30⁺-лимфоцитов относительно контрольной группы наблюдали при активации МАТ. При стимуляции клеток L-PHA быстрее появлялся маркер активации CD25, особенно на поверхности CD56⁺-клеток. Примечательно, что прибавление FCS при активации МАТ вызывало более выраженную экспрессию CD38, CD69, CD25-рецепторов, причем существенно возрастала доля CD56⁺CD25⁺-клеток (относительно активации только МАТ).

 

Таблица 1. Сравнение пролиферативной активности лимфоцитов на 3-и сутки после активации анализируемыми стимуляторами клеточного деления

Table 1. Comparison of proliferative activity of lymphocytes on the 3^rd day after activation by the analyzed stimulators

Концентрация активатора Activator concentration	Поделившиеся клетки, % Divided cells, %
2,5 мкг/мл анти-CD3, 5 мкг/мл анти-CD28 МАТ 2.5 mkg/ml anti-CD3, 5 mkg/ml anti-CD28 mABs	43,21 ± 2,1
2,5 мкг/мл анти-CD3, 5 мкг/мл анти-CD28 + 5 мкг/мл FCS 2.5 mkg/ml anti-CD3, 5 mkg/ml anti-CD28 mABs + 5 mkg/ml FCS	43,4 ± 3,4
5 мкг/мл L-PHA 5 mkg/ml L-PHA	42,3 ± 3,2
5 мкг/мл Con-A 5 mkg/ml Con-A	39,71 ± 1,9
Отрицательный контроль (неактивированные МНК) Negative control (not activated PBMC)	7,0 ± 1,5

Примечание. Здесь и в табл. 2–5: МНК – мононуклеарные клетки периферической крови, МАТ – моноклональные антитела, FCS – фукозилированный хондроитинсульфат, Con-A – конканавалин А, L-PHA – L-фитогемагглютинин.

Note. Here and in Tables 2–5: PBMC – peripheral blood mononuclear cells, mAbs – monoclonal antibodies, FCS – fucosylated chondroitin sulfate, Con-A – concanavalin A, L-PHA – phytohaemagglutinin-L.

 

Таблица 2. Экспрессия активационных маркеров на поверхности лимфоцитов на 3-и сутки после активации анализируемыми стимуляторами клеточного деления

Table 2. Activation markers expression on the surface of lymphocytes on the 3^rd day after activation by the analyzed stimulators

Показатель Parameter	Доля клеток, % Proportion of cells, %
	NKG2D+	NKp30+	CD38+	CD69+	CD3+CD25+	CD56+CD25+
Контроль (неактивированные МНК) Negative control (not activated PBMC)	15,17 ± 3,01	37,0 ± 5,13	1,0 ± 0,74	0,2 ± 0,01	1,26 ± 0,36	0,6 ± 0,16
Активация МАТ Activation of mABs	26,26 ± 1,64	20,72 ± 1,89	82,13 ± 4,03	80,46 ± 4,02	35,12 ± 3,39	1,94 ± 0,06
Активация МАТ + FСS Activation of mABs + FСS	25,8 ± 3,41	18,4 ± 2,33	83,82 ± 7,16	85,3 ± 4,68	57,25 ± 5,77	5,91 ± 1,35
Активация L-PHA Activation of L-PHA	28,73 ± 3,01	13,97 ± 4,03	91,82 ± 6,51	93,96 ± 3,65	73,83 ± 4,45	6,92 ± 1,08
Активация Con-A Activation of Con-A	29,37 ± 2,12	10,62 ± 3,36	99,57 ± 1,03	94,04 ± 4,99	72,78 ± 5,98	5,07 ± 1,78

 

Действие активаторов на лимфоциты при длительном культивировании в течение 21 дня

Далее было необходимо оценить влияние выбранного способа активации при длительном культивировании. Данные о динамике пролиферации относительно времени культивирования представлены на рис. 2. Наибольший прирост клеток наблюдали при активации МАТ + FCS, наименьшим стимулирующим эффектом обладал Con-A. При всех способах активации наблюдали постепенное увеличение эффекторной функции к 21-м суткам культивирования, данные цитотоксического теста представлены в табл. 3.

 

Рис. 2. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов при длительном культивировании. Здесь и на рис. 3: МНК – мононуклеарные клетки периферической крови, МАТ – моноклональные антитела, FCS – фукозилированный хондроитинсульфат, Con-A – конканавалин А, L-PHA – L-фитогемагглютинин

Fig. 2. Dynamics of proliferative activity of lymphocytes during long-term cultivation Here and in Fig. 3: PBMC – peripheral blood mononuclear cells, mAbs – monoclonal antibodies, FCS – fucosylated chondroitin sulfate, L-PHA – phytohaemagglutinin-L, Con-A – concanavalin A

 

Таблица 3. Цитотоксичность в отношении культуры T47D-HER2+, %, при соотношении клеток-мишеней с клетками-эффекторами 5:1

Table 3. Cytotoxicity against the T47D-HER2+ cell culture, %, at a target-to-effector cell ratio of 5:1

Показатель Parameter	После активации After activation
	МАТ mABs	МАТ + FCS mABs + FCS	L-PHA	Con-A
МНК до активации PBMC before activation	63 ± 7
7-й день культивирования 7th day of cultivation	64 ± 6	66 ± 4	67 ± 4	65 ± 6
14-й день культивирования 14th day of cultivation	73 ± 8	78 ± 7	74 ± 5	78 ± 8
21-й день культивирования 21st day of cultivation	87 ± 6	80 ± 6	83 ± 7	81 ± 8

 

К 21-му дню культивирования наибольшее абсолютное и исходя из цитометрических данных относительное количество CD3⁺CD56 ^– -клеток наблюдали при активации L-PHA, иммунорегуляторный индекс при данном способе активации составлял 0,5 (табл. 4, 5). Наибольший иммунорегуляторный индекс (1,4) наблюдали к 21-му дню культивирования при активации Con-A, а добавление FCS к МАТ при активации приводило к снижению иммунорегуляторного индекса относительно активации в присутствии МАТ. На 21-й день культивирования наибольшую долю CD3^–CD56⁺-клеток наблюдали при активации L-PHA и Con-A, а активация МАТ и МАТ + FCS оказывала существенное влияние на пролиферацию CD3⁺CD56⁺-лимфоцитов (рис. 3, см. табл. 4, 5). Максимальное количество CD3⁺CD56⁺-НКТ-клеток получено при активации комбинацией МАТ + FCS. Активация МАТ или МАТ + FCS усиливала экспрессию NKG2D-рецептора на поверхности CD3⁺- и CD56⁺-лимфоцитов, причем прибавление FCS оказывало бóльшее влияние на экспрессию данного рецептора на поверхности CD56+- клеток. При длительном культивировании при активации МАТ доля и абсолютное значение CD16⁺-лимфоцитов к 21-му дню культивирования оставались наибольшими по сравнению с режимами использования других активаторов. Примечательно, что при активации МАТ или МАТ + FCS к 21-му дню культивирования более выраженную экспрессию CD16-рецептора наблюдали на поверхности CD3⁺-лимфоцитов, в то время как при активации ФГА или Con-A более высокая экспрессия CD16-маркера была на поверхности CD56-клеток.

 

Таблица 4. Экспрессия поверхностных маркеров на культивируемых лимфоцитах

Table 4. Expression of surface markers on cultured lymphocytes

Показатель Parameter	МНК до активации PBMC before activation	Активация Activation
		МАТ mABs			МАТ + FCS mABs + FСS			L-PHA			Con-A
		День культивирования Cultivation day
		3-й 3rd	11-й 11th	21-й 21st	3-й 3rd	11-й 11th	21-й 21st	3-й 3rd	11-й 11th	21-й 21st	3-й 3rd	11-й 11th	21-й 21st
Доля CD3+CD56–-клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	79,45 ± 8,4	81,88 ± 9,8	71,03 ± 7,3	45,86 ± 5,6	83,11 ± 9,3	73,62 ± 7,2	41,43 ± 3,0	80,82 ± 8,2	93 ± 6,4	85,81 ± 8,8	71,84 ± 7,7	76,02 ± 7,8	79,85 ± 8,1
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,91 ± 0,1	1,9 ± 0,3	0,6 ± 0,2	0,2 ± 0,16	1,9 ± 0,2	0,4 ± 0,1	0,1 ± 0,03	1,9 ± 0,2	0,9 ± 0,2	0,5 ± 0,1	1,9 ± 0,3	1,7 ± 0,2	1,4 ± 0,2
Доля CD56+-клеток, % Proportion of CD56+ cells, %	19,44 ± 3,1	16,9 ± 1,8	30,2 ± 3,2	54,13 ± 5,7	18,75 ± 2,1	23,32 ± 2,6	58,91 ± 6,0	17,42 ± 1,8	5,2 ± 0,7	11,45 ± 1,4	18,49 ± 1,9	10,4 ± 1,3	19,52 ± 2,1
Доля CD3-CD56+-клеток, % Proportion of CD3-CD56+ cells, %	13,14 ± 2,9	12,61 ± 2,8	3,88 ± 0,6	2,02 ± 0,4	13,14 ± 1,4	4,15 ± 0,5	1,81 ± 0,3	13,2 ± 1,6	2,39 ± 0,3	6,12 ± 0,9	12,83 ± 1,5	3,51 ± 0,4	5,74 ± 0,7
Доля CD3+CD56+-клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	6,53 ± 2,4	4,34 ± 0,8	27,22 ± 3,7	52,11 ± 5,5,	5,61 ± 0,6	19,22 ± 2,2	57,12 ± 6,1	4,22 ± 0,7	2,81 ± 0,4	5,45 ± 0,8	5,66 ± 0,6	6,89 ± 0,8	13,82 ± 1,5
Доля NKG2D+-клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	29,32 ± 3,3	26,08 ± 3,0	69,81 ± 8,1	82,68 ± 8,3	23,68 ± 2,6	65,83 ± 6,7	84,34 ± 7,9	27,73 ± 3,2	57,98 ± 6,3	64,47 ± 7,1	25,92 ± 2,8	31,52 ± 3,3	50,06 ± 5,9
Доля CD56+NKG2D+-клеток, % Proportion of CD56+ NKG2D+ cells, %	18,61 ± 2,4	15,22 ± 1,8	27,86 ± 4,0	50,84 ± 5,5	14,87 ± 1,7	28,03 ± 3,1	40,36 ± 8,8	16,72 ± 1,9	7,62 ± 0,9	13,49 ± 1,6	17,38 ± 1,6	9,86 ± 1,2	21,54 ± 2,4
Доля CD3+NKG2D+-клеток, % Proportion of CD3+ NKG2D+ cells, %	17,48 ± 2,7	14,98 ± 1,8	68,03 ± 7,2	80,66 ± 7,9	14,02 ± 1,5	65,32 ± 6,8	82,41 ± 8,3	15,02 ± 1,7	55,35 ± 6,1	57,37 ± 6,1	16,27 ± 1,7	28,46 ± 2,6	44,62 ± 4,8
Доля CD16+-клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	17,65 ± 2,4	13,21 ± 2,2	1,99 ± 0,3	7,33 ± 0,8	12,86 ± 1,5	1,49 ± 0,4	6,82 ± 0,7	10,71 ± 1,5	2,22 ± 0,4	6,87 ± 0,7	10,38 ± 1,2	2,96 ± 0,4	4,06 ± 0,6
Доля CD3+CD16+-клеток, % Proportion of CD3+CD16+ cells, %	5,98 ± 1,4	1,52 ± 0,9	0,57 ± 0,4	5,6 ± 0,5	1,62 ± 0,3	0,66 ± 0,2	5,52 ± 0,7	4,76 ± 0,5	0,24 ± 0,2	0,89 ± 0,2	0,71 ± 0,3	0,42 ± 0,1	0,39 ± 0,2
Доля CD56+CD16+-клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	15,67 ± 1,9	11,69 ± 1,5	1,42 ± 0,5	1,73 ± 0,2	12,07 ± 1,5	1,11 ± 0,2	1,64 ± 0,3	5,95 ± 0,7	1,98 ± 0,4	5,98 ± 0,6	9,67 ± 1,1	2,54 ± 0,3	3,67 ± 0,6

 

Таблица 5. Абсолютное значение количества клеток, экспрессирующих определенные рецепторы

Table 5. Absolute value of the number of cells expressing certain receptors

Количество клеток, × 106 Number of cells, × 106	МНК до активации PBMC before activation	Активация на 21-й день культивирования Activation on the 21st day of cultivation
		МАТ mABs	МАТ + FCS mABs + FСS	L-PHA	Con-A
CD3+CD56–	2,4 ± 0,22	66,7 ± 6,5	68,3 ± 7,1	98,2 ± 10,1	66,9 ± 6,9
CD3–CD56+	0,4 ± 0,05	2,9 ± 0,3	3,0 ± 0,4	7,0 ± 0,8	4,8 ± 0,5
CD3+CD56+	0,2 ± 0,02	75,8 ± 7,8	94,1 ± 9,6	6,2 ± 0,8	11,6 ± 1,4
NKG2D+	0,9 ± 0,1	120,3 ± 11,9	139,0 ± 14,0	73,8 ± 7,7	41,9 ± 4,4
CD16+	0,5 ± 0,06	10,7 ± 1,2	11,2 ± 1,4	7,9 ± 0,9	3,4 ± 0,6
CD56+CD16+	0,8 ± 0,1	2,86 ± 0,4	2,7 ± 0,3	6,8 ± 0,9	3,0 ± 0,4

 

Рис. 3. Изменения популяционного состава первичной культуры лимфоцитов к 21-му дню культивирования в зависимости от способа активации. Данные репрезентативного эксперимента, активация: а – МАТ; б – МАТ + FCS; в – L-PHA; г – Con-A. PE – R-фикоэритрин; FITC – изотиоцианат флуоресцеина; Q10-1: CD3^–CD(56⁺16)⁺-клетки; Q10-2: CD3⁺CD(56⁺16)⁺-клетки; Q10-3: CD3^–CD(56⁺16)^–-клетки; Q10-4: CD3⁺CD(56⁺16)^–-клетки

Fig. 3. Changes in lymphocyte composition by the 21^st day of cultivation depending on the activation method. Data from a representative experiment, activation: а – mABs; б – mABs + FCS; в – L-PHA; г – Con-A. PE – R-phycoerythrin; FITC – fluorescein isothiocyanate; Q10-1: CD3 ^– CD (56⁺16)⁺ cells; Q10-2: CD3⁺CD(56⁺16)⁺ cells; Q10-3: CD3^–CD(56⁺16)^– cells; Q10-4: CD3⁺CD(56⁺16)^– cells

 

Обсуждение

Суммируя полученные результаты, следует отметить, что выбранные активаторы пролиферации при длительном культивировании влияли на первичную культуру лимфоцитов по-разному. Так, L-PHA наилучшим образом стимулировал деление Т-лимфоцитов (CD3⁺CD56^–) и НК-клеток (CD3^–CD56⁺) относительно других режимов активации. Увеличение доли, а также абсолютного числа CD16⁺-лимфоцитов было связано, по-видимому, с пролиферацией CD56⁺CD16⁺-популяции НК-клеток, обладающей выраженными цитотоксическими свойствами. При активации L-PHA появление маркера активации CD25 на поверхности CD56⁺-лимфоцитов также было наивысшим относительно применения других активирующих пролиферацию веществ, что, вероятно, связано с быстрой активацией CD56⁺-клеток в ответ на контакт с L-PHA. Согласно данным литературы, влияние L-PHA на Т-клетки не только приводит к пролиферации Т-клеточного звена, но и стимулирует образование Т-клеток памяти [14].

Несмотря на наименьший прирост количества культивируемых лимфоцитов при воздействии Con-A, данный активатор значительно стимулировал CD3⁺CD4⁺-лимфоциты. Данное явление было также описано и в другой научной публикации [13]. Предполагается, что появление популяции хелперов оказало влияние и на деление НКТ-клеток (CD3⁺CD56⁺), доля которых возрастала относительно стимуляции L-PHA, хотя нельзя исключать и прямого стимулирующего действия Con-A на популяцию НКТ-клеток. Минимальная, относительно других режимов активации, экспрессия активационного рецептора NKG2D при стимуляции Con-A связана, по-видимому, с небольшой долей CD3⁺- или CD56⁺-клеток-эффекторов.

При сравнении активации клеток под воздействием МАТ относительно применения L-PHA и Con-A наблюдали наиболее выраженный прирост CD3⁺CD56⁺-популяции и уменьшение доли CD3⁺ CD56^–-лимфоцитов. Несмотря на экспансивный рост численности НКТ-клеток, абсолютное число Т-лимфоцитов к концу срока культивирования оказалось ниже, чем при стимуляции L-PHA и таким же относительно активации Con-A. Противоположно стимуляции Con-A при активации МАТ + FCS наблюдали наибольшую долю NKG2D⁺-клеток, практически вся популяция НКТ-клеток экспрессировала данный активационный маркер. НКТ-лимфоциты являются долгоживущей клеточной популяцией, поэтому использование «классического» Т-клеточного активатора при соблюдении режима длительного культивирования в данном случае приводит к преобладанию этих клеток в первичной культуре иммунных клеток к концу срока культивирования. Вследствие этого многие протоколы для экспансии НК-клеток включают длительный режим культивирования – до 21 дня, в то время как для экспансии Т-лимфоцитов достаточно 7–14 дней [23].

Добавление FCS при стимуляции МАТ вызывало более выраженную экспрессию CD38, CD69, CD25-рецепторов на ранних сроках культивирования и приводило к возрастанию доли CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов относительно активации в присутствии МАТ. Так как при данном способе активации наблюдали наибольшую пролиферацию лимфоцитов, можно предположить, что комбинация МАТ + FCS являлась наиболее эффективным из представленных в данной работе способом стимуляции пролиферации первичной культуры лимфоцитов. Среди представленных способов активации МНК для стимуляции деления НК- и НКТ-клеток также наиболее предпочтителен способ активации МАТ + FCS, поскольку при этом наблюдается наибольший прирост общего количества клеток при максимальной доле CD56⁺-лимфоцитов, составляющей 58,9%.

Важным вопросом, требующим отдельного исследования, является выяснение механизма действия FCS и идентификация соответствующих клеточных рецепторов, взаимодействующих с FCS. Вероятно, это можно сделать с использованием модифицированных образцов FCS [24], синтетических олигосахаридов, отражающих структурные фрагменты FCS, синтез которых в настоящее время является возможным [25–27].

Заключение

Таким образом, подбор активатора пролиферации при культивировании первичной культуры лимфоцитов, полученной из МНК без разделения клеточных популяций, следует осуществлять исходя из конкретных экспериментальных задач. Среди рассматриваемых в данной работе стимуляторов пролиферации наиболее предпочтительным вариантом для обогащения популяции CD56⁺-лимфоцитов оказалась комбинация МАТ + FCS и режим длительного культивирования в течение 21 дня. Тем не менее, чтобы подтвердить данное утверждение, необходимы дополнительные исследования с анализом других рассматриваемых параметров, например эффективности генетической модификации лимфоцитов, проводимой после этапа активации выбранным митогеном. Для более успешного обогащения целевой популяции НК-клеток предлагается использование других, не описанных в данной работе, активаторов, аллогенных фидерных клеток, являющихся мишенью для НК-клеток, и/или методов разделения клеточных популяций.

About the authors

Polina O. Fedorova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenovskiy University), Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-8783
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115522; 5A Maly Kazenny Lane, Moscow, 105064; build. 2, 8 Trubetskaya St., 119048, Moscow

Irina O. Chikileva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0769-1695
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115522

Alexandra I. Tokatly

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2855-8738
Russian Federation, 47 Leninsky Prospekt, Moscow, 119991

Anatoly I. Usov

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0009-0008-7262-2235
Russian Federation, 47 Leninsky Prospekt, Moscow, 119991

Maria I. Bilan

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-2390-3776
Russian Federation, 47 Leninsky Prospekt, Moscow, 119991

Nikolay E. Nifantiev

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0727-4050
Russian Federation, 47 Leninsky Prospekt, Moscow, 119991

Mikhail V. Kiselevskiy

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0132-167X
Russian Federation, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115522

References

Supplementary files